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島津中國創(chuàng)新中心與北京知名CRO公司合作，采用島津二維液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（2D LCMS-QTOF）對阿米卡星注射液的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。阿米卡星極性較大，個(gè)別雜質(zhì)保留較弱，給色譜分離和二維脫鹽帶來挑戰(zhàn)。本研究二維采用高保留色譜柱成功實(shí)現(xiàn)在線脫鹽，獲取雜質(zhì)高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)預(yù)測雜質(zhì)分子式，并結(jié)合二級特征碎片推測雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)。本研究成果有助于相關(guān)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝、提升產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

背景介紹

阿米卡星（amikacin）是一種半合成的氨基糖苷類抗生素，以卡那霉素為起始物料通過一系列反應(yīng)合成。阿米卡星的分子式為C22H43N5O13，具有抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的作用，適用于革蘭陰性桿菌和對青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌引起的感染。與慶大霉素類似，阿米卡星的臨床副反應(yīng)主要是聽覺神經(jīng)損壞和腎毒性。阿米卡星無口服制劑，只有注射劑和滴眼液，目前仿制藥注射劑一致性評價(jià)是新藥研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。《中國藥典》2020年版收載阿米卡星，采用反相Ｃ18色譜柱，辛烷磺酸鈉-硫酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液－乙腈為流動相對5種已知有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制。本文參考 2020版《中國藥典》建立阿米卡星注射液有關(guān)物質(zhì)檢查方法。在阿米卡星臨用新制樣品中發(fā)現(xiàn)3種未知雜質(zhì)，使用島津二維液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析。

圖1 阿米卡星注射液樣品色譜圖

島津解決方案

n                      分析儀器

島津液相系統(tǒng)Nexera LC-40 +高分辨質(zhì)譜儀LCMS-9030

n                      二維分析條件

色譜柱：ShimNex HE C18-AQ（3.0 mm I.D. ×100 mm L., 3 μm）

流動相：流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，梯度洗脫

上樣體積：50 μL

質(zhì)譜離子源：ESI（+）；質(zhì)譜掃描范圍：m/z 80 ~ 1200

采用二維柱切換技術(shù)在線脫除組分中的無機(jī)鹽，通過二維色譜柱分離未知雜質(zhì)與辛烷磺酸鈉，摸索未知雜質(zhì)在二維的出峰時(shí)間并設(shè)置相應(yīng)的質(zhì)譜檢測窗口。基于LCMS-9030飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨，高質(zhì)量準(zhǔn)確度和二級特征譜圖定性的功能，獲取雜質(zhì)的質(zhì)譜信息。通過比較阿米卡星與未知雜質(zhì)的母離子和特征碎片離子的相關(guān)性對未知雜質(zhì)進(jìn)行科學(xué)合理的定性分析。

圖2 RT 10.11雜質(zhì)的ESI正模式

一級質(zhì)譜圖（上）和二級質(zhì)譜圖（下）

以保留時(shí)間(RT)10.11雜質(zhì)為例，介紹阿米卡星雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定過程。使用島津分子式預(yù)測軟件Formula Predictor Server對RT 10.11未知雜質(zhì)進(jìn)行分子式預(yù)測，可能的分子式為C16H32N4O9，理論精確分子量為424.2169。未知雜質(zhì)一級質(zhì)譜圖中m/z 425.2242為[M+H]+，分子量相對誤差為0 ppm，表明島津高分辨質(zhì)譜高質(zhì)量準(zhǔn)確度的性能。二級質(zhì)譜圖中可見m/z 163特征碎片離子，表明雜質(zhì)具有氨糖結(jié)構(gòu)。RT 10.11雜質(zhì)的分子式比阿米卡星少C6H11NO4，恰好為1分子氨糖。推測其為阿米卡星氨糖水解產(chǎn)物，中國藥典未收錄該雜質(zhì)。RT 10.11可能的二級裂解規(guī)律見圖3，四種二級碎片均可進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)預(yù)測。

圖3 RT 10.11雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律

結(jié)論

阿米卡星是臨床常用的氨基糖苷類抗生素，島津中國創(chuàng)新中心與客戶合作使用二維液相高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜2D LCMS-QTOF成功對阿米卡星注射液中未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。本文所建立的色譜方法具有快速、高分離度的優(yōu)點(diǎn)，為阿米卡星注射液有關(guān)物質(zhì)分離及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了一定的參考。

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