體積排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，通常用于分子量大于2000的樣品的分離。SEC方法zui廣泛的用途是測定聚合物的分子量分布，對某些大分子樣品如蛋白質、核酸等，也是種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡便快速地分離樣品中分子量相差較大的組分，因而適合于未知樣品的初步探索性分離，無需進行復雜實驗就能較為全面地了解樣品組成分布的概況。
體積排阻色譜原理
分子的體積排阻，樣品組分和固定相之間原則上不存在相互作用，色譜柱的固定相是具有不同孔徑的多孔凝膠，在固定相確定的分子量范圍內，洗脫順序按照分子大小分布。當樣品分子量較大，以至于被wan全排除在固定相微孔之外時（全排阻），其保留體積等于色譜柱內微粒間的空隙體積；而分子量足夠小的分子可以wan全進入微孔中，其保留體積為空隙體積和固定相中微孔體積之和，因此小的溶質分子保留時間長，洗脫體積大，而大的溶質分子保留時間短，洗脫體積小。固定相的分子量測定范圍即為全滲透和全排阻之間的分子量范圍。
理想的體積排阻色譜固定相應具有窄的孔徑分布范圍，而系列色譜固定相應具有寬范圍的孔徑分布，可根據樣品的不同選擇不同分子量范圍的SEC柱，也可將不同規格的SEC柱串聯使用，用于分離更大分子量范圍的樣品。
體積排阻色譜的分類
凝膠過濾色譜法-GFC
一般用于分離水溶性的大分子，凝膠的代表是葡聚糖系列，洗脫溶劑主要是水。
凝膠滲透色譜法-GPC
主要用于有機溶劑中可溶的高聚物相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。
兩種方法的分離原理雖然相同但采用的固定相、分離對象和使用技術wan全不同。
分類 | 凝膠過濾色譜 GFC | 凝膠滲透色譜 GPC |
固定相 | 低交聯度多孔聚合物 （在有機溶劑中會溶脹） 如葡聚糖，瓊脂糖， 聚丙烯酰胺 | 交聯聚苯乙烯樹脂 （在有機溶劑中溶脹性較小）如聚乙烯-二苯乙烯共聚物 |
流動相 | 采用水溶液或緩沖液 作為流動相 | 有機溶劑，THF，DMF， 三氯ji烷等 |
應用對象 | 多肽生物大分子蛋白質， 纖維素衍生物， 聚乙烯醇多糖類 | 結晶合成聚合物， 小分子聚合物 |
優缺點 | 條件溫和， 分離機理簡單， 操作參數少， 耐高溫， 選擇性低 | 使用廣泛，滲透性好， 柱效高，不宜長期高溫 條件使用 |
體積排阻色譜流動相的選擇
體積排阻色譜法中，實際的分離效果與樣品、流動相之間的相互作用無關，因此改變流動相的組成一般不會改變分離度。當采用示差折光檢測器時，為提高檢測靈敏度，應使流動相的折射率與被測樣品的折射率有盡可能大的差別。若使用紫外吸收檢測器，也應采用在檢測波長無紫外吸收的溶劑。
體積排阻色譜法中流動相的選擇原則：
01
流動相對樣品應有足夠的溶解能力，黏度小，與檢測器匹配。
02
流動相必須與固定相匹配，能浸潤凝膠，如對苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相選擇非極性流動相；多孔硅膠固定相應選擇極性強的流動相。
03
為增加樣品溶解度而采用高柱溫操作時，應選用高沸點溶劑。
凝膠滲透色譜主要用于高聚物分子量的測定。四氫呋喃對此類樣品有良好的溶解性能，可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被廣泛使用作為GPC流動相。但因其在儲運過程中特別是在光照射條件下，容易生成過氧化物，使用前必須除去。二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、間甲酚等溶劑可在高柱溫條件下使用；強極性的六氟異丙醇、三氟乙醇等可用于粒度小于10μm的凝膠柱。
在凝膠過濾色譜中，通常以具有不同pH值的緩沖溶液作為流動相。當采用親水性有機凝膠（葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅膠或改性硅膠為固定相時，固定相與樣品間可能存在多種相互作用影響GFC測定準確性，可在流動相中添加少量無機鹽以保持一定的離子強度（0.1~0.5mol/L），其中鈉、鉀、銨等的硫酸鹽、磷酸鹽消除吸附作用的效果較好。當使用硅膠基質凝膠時，流動相的pH值應保持在4~8的范圍，以免硅膠鍵合相被破壞。
月旭產品介紹
月旭科技Xtimate® SEC填充劑采用du特的化學鍵合技術，在硅膠表面鍵合親水性聚合物以及親水性二醇基團，雙重鍵合機制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應用于水溶性聚合物及生物大分子的分離和測定。
固定相 | SEC- 120 | SEC- 300 | SEC- 500 | SEC- 700 | SEC- 1000 | SEC- 2000 |
填充劑 | 球狀親水改性硅膠 | |||||
孔徑? | 120 | 300 | 500 | 700 | 1000 | 2000 |
蛋白分子量范圍 | 500- 150000 | 5000- 1250000 | 10000- 3500000 | 15000- 5000000 | 50000- 7500000 | ＞10000000 |
水溶性高分子范圍 | 500- 25000 | 1000- 100000 | 2000- 500000 | 2500- 500000 | 5000- 1500000 | 50000- 2500000 |
pH | 2-7.5 | |||||
最大壓力（psi） | 4500 | 3500 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 |
色譜柱的異常沖洗
多次使用后某些樣品可能會吸附到入口篩板或填料上。當積累至一定程度時會出現壓力升高并伴隨峰形展寬的異常現象，需要進行特殊的沖洗。
該沖洗的清洗溶液選擇的基本原則：
01
低pH的鹽溶液有助于移除堿性蛋白（如0.5M硫酸鈉溶液，硫酸調整pH3.0）。
02
有機溶劑有助于移除疏水蛋白，可以采用含有機溶劑（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的緩沖溶液（如50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0）。
03
助溶劑有助于去除在固定相上強吸附的物質（如通過氫鍵作用等）。
注意：只有在中性鹽溶液或有機溶劑沒有明顯改善效果的情況下使用助溶劑（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸鈉）。
流速一般采用1/2做樣流速，柱長≤100mm，各項沖洗60min；柱長＞100mm，各項沖洗120min。
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