菌落總數測定操作步驟及注意事項

一、測定標準

參考食品國家標準：GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

二、操作過程

1、前期準備：

根據國家標準，提前準備好要用的平板計數瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等，相應的材料進行滅菌處理（干熱滅菌或高壓滅菌）。

2、接收樣品：

收到樣品后，確認樣品包裝是否完好，登記樣品信息，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在取樣時取出。

3、樣品處理：

按照作業指導書操作，仔細閱讀實驗要求。一般實驗室收到的是干粉樣品、固體樣品、或者液體樣品等。假如收到干粉樣品，那么首先需要將其配置成水溶液（即水化）。根據實驗要求及經驗，進行預判，預估稀釋液倍數，溶解即可。

4、實驗前準備：

4.1實驗操作最好在超凈臺或者生物安全柜里操作，需要把超凈臺或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實驗環境無菌。

4.2提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺上紫外殺菌。

5、實驗操作：

5.1稀釋

將樣品從冰箱中取出達到室溫后開始取樣，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進行洗滌并全部轉入無菌瓶或袋中。

洗滌轉移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進行均質混勻，一般作為原液立刻進行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1ml無菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

5.2傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至46℃的平板計數營養瓊脂培養基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。傾注過程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30°左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺面上。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h。

5.3觀察計數

24h觀察檢測結果有無異常現象，是否有蔓延菌落出現。48h再按照GB 4789.2的要求進行菌落計數。在對結果進行分析后，選取檢測結果的平均值為最終數據。

三、注意事項

1、當無法預判樣品菌落總數含量時，需要梯度稀釋，此步驟尤其關鍵，必須盡可能地減少誤差。

2、傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易凝固，不能與菌液充分混勻。如無水浴條件，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

3、傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚會影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。

4、傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

5、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然后應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不易過長，以防止細菌有所死亡或繁殖。

6、瓊脂培養基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現平皿不凝固現象；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

7、冷卻的過程不要著急，冷卻充分后再倒置放進培養箱培養，放置的時候要盡量避免放到風機口處，每摞不要超過6個平皿。

8、檢測結束后所有的稀釋液樣品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以備實驗出錯時再用。

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