• 一定時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)幾種不同信號(hào)

• 利用多種算法和曲線擬合全面分析數(shù)據(jù)

• 使用工作流程編輯器建立一套簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)介

在一段時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)幾種不同信號(hào)的輸出尤其在研究蛋白或化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或基因表達(dá)作用方面很有幫助。在本應(yīng)用指南里，我們利用SoftMax® Pro 7版本軟件同時(shí)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(光吸收)和蛋白表達(dá)(熒光)。

在細(xì)菌中，lac操縱子是一種由編碼ß-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子調(diào)控的基因群。將一個(gè)蛋白表達(dá)序列插入到含有l(wèi)ac操縱子的質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)染細(xì)菌，可使這一轉(zhuǎn)化細(xì)菌來(lái)表達(dá)感興趣的蛋白。通常情況下，lac啟動(dòng)子是被變構(gòu)抑制的，但是在異丙基-ß-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下，阻遏物從啟動(dòng)子序列釋放引起感興趣蛋白的的表達(dá)。相反，如果IPTG過(guò)量，細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先將胞內(nèi)物質(zhì)用于蛋白表達(dá)并且細(xì)胞生長(zhǎng)也會(huì)受到阻礙。

通過(guò)同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)，我們展示了大腸桿菌(E.coli)是如何響應(yīng)系列稀釋的IPTG的。

材料

 ·  SpectraMax® M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices)

 ·  Luria Broth (LB)培養(yǎng)基(Teknovacat.#L8080)

 ·  氨芐青霉素(Teknova cat.#A9525)

·  1 M IPTG (Teknova cat. #I3431)

·  96-孔透明平底聚苯乙烯多孔板(Greiner cat. #655-161)

·  含有pBbE5-RFP的E. coli質(zhì)粒(Keasling Lab)

方法

包含pBbE5-RFP質(zhì)粒(圖1)的大腸桿菌(E. coli)由JayD.Keasling2教授提供。大腸桿菌(E. coli)菌株培養(yǎng)在含有100μM氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)到OD600為0.3時(shí)，再將100μL的大腸桿菌(E.coli)轉(zhuǎn)移到透明96孔板中。用起始濃度500 μM的IPTG兩倍系列稀釋來(lái)處理大腸桿菌(E.coli)。0 μM IPTG和只含培養(yǎng)基的對(duì)照也分別進(jìn)行檢測(cè)。

微孔板放入SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀中3 2 °C孵育并用動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)。利用SoftMaxPro7軟件的工作流程編輯器，創(chuàng)建包括光吸收和熒光兩種檢測(cè)方法的動(dòng)力學(xué)循環(huán)，讀數(shù)之間震板10秒，參數(shù)設(shè)置如表1。循環(huán)每10分鐘1次，共24小時(shí)。使用SoftMax Pro7版本軟件對(duì)產(chǎn)生的兩種檢測(cè)方法的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

結(jié)果

光吸收和熒光檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)曲線分別由圖2和圖3所示。圖2中，不斷增加IPTG濃度導(dǎo)致OD600下降，意味著對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)起反作用。圖3中，提高IPTG濃度不會(huì)引起紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)量的增加。相反，提高IPTG濃度會(huì)導(dǎo)致總RFP表達(dá)量的減少。這一減少可能是因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)停滯造成的。

在圖4中，對(duì)光吸收和熒光數(shù)據(jù)做處理以計(jì)算曲線下的面積(AUC)。采用SoftMaxPro7版本軟件進(jìn)行分析并總結(jié)出IPTG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響。IPTG對(duì)熒光的影響在除500 μM濃度外的其他所有濃度中效果都是相似的，即提高IPTG濃度導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)下降(光吸收)。

計(jì)算RFP/OD600的比值可以用來(lái)測(cè)定蛋白表達(dá)相對(duì)于細(xì)菌群體密度。使用SoftMaxPro7版本軟件，我們計(jì)算出RFP/OD600比值(圖 5)。基于動(dòng)力學(xué)追蹤，250 μMIPTG處理的細(xì)菌每個(gè)細(xì)胞所表達(dá)的RFP是zui多的。

結(jié)論

我們展示了Molecular Devices SoftMaxPro7版本軟件和多功能酶標(biāo)儀配合使用能夠在一段時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)許多生物學(xué)事件。盡管展示的實(shí)驗(yàn)較為簡(jiǎn)單，但這一應(yīng)用也適合于更為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

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