概要

l   在 Biomek FX 工作站上自動進行基質(zhì)膠培養(yǎng)物的平板接種、藥物治療和染色

l   溫度控制位置保持基質(zhì)膠呈液體形式并誘導膠化

l   通過減少基質(zhì)膠的使用，優(yōu)化移液可節(jié)省成本

l  使用以下方法測定基質(zhì)膠培養(yǎng)物中的細胞生長和凋亡誘導：

l  配備 SpectraMax MiniMax 300 成像細胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 多功能檢測平臺

l  ageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

簡介

研究人員正在將三維 （3D） 細胞培養(yǎng)作為一種提高其疾病模型和藥物研究預測價值的生物學相關性的方法。這些 3D 模型通常會提高細胞間相互作用的水平，并減少或消除了在標準單層培養(yǎng)物中觀察到的明顯的細胞-塑料介質(zhì)間相互作用。有多種生成方法3D 細胞培養(yǎng)物，每種具有優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，有些挑戰(zhàn)可以通過自動化幫助克服。

在三維空間中培養(yǎng)細胞的一種常見方法是通過使用細胞外基質(zhì)水凝膠如 Matrigel。Matrigel 和 2D 細胞培養(yǎng)物之間的差異可通過其不同的細胞形態(tài)很容易地看到（圖 1），細胞極性和/或基因表達（Baker 和 Chen）。Matrigel 還可以研究細胞遷移和3D 結構形成，例如血管生成研究中的內(nèi)皮細胞管形成

Matrigel 的特性之一是它僅在低溫條件下是液態(tài)，在室溫下或 37°C 下凝固成凝膠。 細胞通常生長在基質(zhì)膠涂層上或包埋在較厚的基質(zhì)凝膠層（圖 1）中，補充介質(zhì)通常添加到水凝膠層之上，隨后凝固。在 Matrigel 中檢測細胞生長也可能存在問題。檢測方法包括使用讀板機或成像設備

在細胞仍留在基質(zhì)中或緩慢溶解基質(zhì)膠的同時對其進行檢測，以觀察懸浮細胞或裂解物。所有這些步驟在手動執(zhí)行時都面臨重大挑戰(zhàn)，我們將介紹我們?nèi)绾卫?/span>自動化來進行平板接種、處理和制備 Matrigel 培養(yǎng)物進行分析。此外，自動化技術使用 384 孔板，可減少每個步驟中基質(zhì)膠和其他昂貴試劑的使用量，從而節(jié)省大量成本。

圖 1：在標準單層培養(yǎng)物 （A）、基質(zhì)膠表面（B）或嵌入基質(zhì)膠層中（C）的 HCT 116 細胞的圖像。比例尺 = 500 微米。

自動化基質(zhì)膠鋪板和培養(yǎng)

Matrigel 工作流程在 Biomek FX 工作站（貝克曼庫爾特公司）上自動進行，該工作站具有 96 通道頭和 Span-8

移液器（圖 2）。靈活的 Biomek 工作站配置了多個溫度控制的 Peltier 位置以液體形式維持基質(zhì)凝膠，并加熱檢測板以誘導凝膠聚合。96 通道頭增強多通道選擇性吸頭移液 （EST），允許使用任何吸頭模式。自動化細胞的無菌性操作通過使用無菌 Biomek 移液器吸頭和 HEPA 過濾外殼進行保護，且無污染即使在細胞培養(yǎng)基中沒有抗生素的情況下也能檢測到無污染。

細胞鋪板

用 FluoroBrite DMEM 培養(yǎng)基（Thermo Fisher科學）稀釋冰上解凍的無酚紅的基質(zhì)膠（Corning）至6mg/ml，對于嵌入式培養(yǎng)，將 HCT 116 細胞加入至 100，000 個細胞/mL 的濃度。基質(zhì)膠將（+/- 細胞）添加到深孔板的單柱中，該單柱在振蕩的 Peltier 裝置上用深孔適配器保持 4°C，。使用多通道 EST 功能以柱狀方式向 384 孔黑壁透明底板 （Greiner） 的孔中加入 25 μL 。然后將該檢測板在靜態(tài)Peltier上加熱至37°C，持續(xù)30分鐘，以固化基質(zhì)膠。然后將含有 10% FBS 的 75 μL FluoroBrite DMEM 培養(yǎng)基加入每個孔中。對于在基質(zhì)膠表面的培養(yǎng)物生長，HCT 116 細胞添加到補充培養(yǎng)基中，而不是添加到基質(zhì)膠中。最終細胞接種數(shù)量為2500 個細胞/孔用于嵌入式培養(yǎng)，8000 個細胞/孔用于表面培養(yǎng)。

如上所述，在接種基質(zhì)膠培養(yǎng)時存在許多挑戰(zhàn)。自動化能夠始終如一地將移液槍頭置于孔底上方 0.3 mm 處，使少量的基質(zhì)膠將擴散到覆蓋整個孔。需要手動移液會接觸孔底（可能劃傷和/或影響轉(zhuǎn)移體積）或孔的側面，導致基質(zhì)凝膠液滴粘附在孔的側面，且未能覆蓋孔。通過手動轉(zhuǎn)移可以實現(xiàn)穩(wěn)定的孔覆蓋是將基質(zhì)膠體積加倍至 50μL，導致實驗成本翻倍。

自動化鋪板的另一個優(yōu)勢是能夠使用慢速抽吸、分配和混合速度以避免Matrigel 溶液中產(chǎn)生氣泡。我們還向移液管吸頭中額外抽吸少量基質(zhì)膠，以避免分配至檢測板時引入氣泡。雖然它們是 Matrigel 培養(yǎng)物的常見抱怨，但

在自動平板接種后沒有在培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)氣泡。培養(yǎng)物在處理和/或分析之前在 37°C 下在 5% CO2 培養(yǎng)箱中儲存不同時間。

細胞生長檢測

為測定基質(zhì)膠表面培養(yǎng)物的初始細胞生長，在前三天的培養(yǎng)中，每天向孔中加入 100 μL XTT 試劑。使用 SpectraMax i3X 多功能檢測平臺在 475 nm 和 660 nm 處測量吸光度（“SpectraMax i3X 讀板機"，Molecular Devices，圖 2）。觀察到線性生長速率 （R2 = 0.985），表明在該時間范圍內(nèi)生長 8000 個細胞（圖 3A）。第 3 天吸光度的輕微穩(wěn)定可能反映出生長變慢，但更有可能表明我們即將達到 XTT 檢測的吸光度最大值，縮短試劑孵育時間以獲得更多時間點。

圖 2. 使用Biomek FX 工作站（左）對基質(zhì)膠培養(yǎng)物進行鋪板、處理和染色。然后用配備 MiniMax 細胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 讀板機（中間）或 ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)（右圖）分析。

由于 XTT 檢測是一種終點檢測，我們還試圖以非標記方式追蹤細胞生長。我們使用 SpectraMax

i3X 讀板機，配備 SpectraMax MiniMax 300 成像細胞計數(shù)器（“MiniMax 細胞計數(shù)器"，Molecular Devices），用于測量被表面菌落占據(jù)的孔的百分比（“field"分析設置）。盡管平板基質(zhì)膠的輕微凹面妨礙了平面的清晰，但隨著時間的推移很容易檢測到表面菌落融合度的變化（數(shù)據(jù)未顯示）。更重要的是，這些培養(yǎng)物的菌落形態(tài)使得細胞數(shù)量翻倍可能不會融合度增加兩倍。XTT 檢測可提供更準確的細胞數(shù)量增加表現(xiàn)，但成像方法可作為合理的替代方法，以確保細胞生長穩(wěn)定，同時允許細胞在未來繼續(xù)用于實驗。

在對嵌入基質(zhì)膠的培養(yǎng)物進行成像時，缺乏焦平面甚至更具挑戰(zhàn)性。但是，我們能夠使用在 MiniMax 細胞計數(shù)儀上進行場測量，以再次查看接受不同細胞接種的孔之間的差異 以及跟蹤隨時間推移的增長。圖 3B 顯示了在 MiniMax 細胞儀上采集和分析的孔圖像以識別存在細胞的區(qū)域。人們可以看到，在三天的時間內(nèi)，被識別的細胞數(shù)量不斷增加。該圖 3C 繪制了其他細胞鋪板數(shù)的融合度水平。同樣，雖然可能不是直接的測定細胞數(shù)量增加，但生長曲線中的高線性水平（R2 值在 0.968 至0.999），且接種細胞數(shù)量之間的清晰的區(qū)別表明這種方法可用于追蹤以非標記方式包埋基質(zhì)膠培養(yǎng)物。

圖 3. 分析基質(zhì)膠上/基質(zhì)膠中的細胞生長。A） 對在三天內(nèi)在基質(zhì)膠表面生長的 8000 個細胞的 XTT 測定。

使用 XTT 試劑孵育 4 小時后，在 SpectraMax i3X 讀板機上進行光吸收檢測。B） Matrigel中HCT116細胞 的匯合度

使用帶 MiniMax 細胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 讀板機進行現(xiàn)場分析測量，。圖像顯示

在三天內(nèi)增加 2500 個細胞的識別面積。C） 不同起始細胞數(shù)量的融合度測量圖。

在最初三天培養(yǎng)中，所有細胞數(shù)量的融合度均呈高度線性（R2 0.968 至 0.999）。

化合物處理和凋亡分析

化合物稀釋和添加

3D 培養(yǎng)的目標之一是確定細胞在更具生物相關性的系統(tǒng)中對刺激的反應。我們想確定在 Matrigel 中生長的結腸癌細胞如何對凋亡誘導劑作出反應。接種 HCT 116 細胞后 5 天將細胞凋亡誘導化合物用 NucBlue® Live ReadyProbes® 試劑（Thermo FisherScientific）稀釋至以下濃度：10 μM 星孢菌素、20 μM 喜樹堿和 375 μM5-氟尿嘧啶。化合物由于需要較長的孵育時間來對基質(zhì)膠中的細胞核進行染色，因此在 NucBlue 中稀釋。添加這些溶液至 96 孔圓底板的第一行，Span-8 移液器將含 1% DMSO 的 NucBlue 轉(zhuǎn)移至板的剩余行。然后使用 EST 按 1：3 的順序連續(xù)稀釋化合物，留下最后一行作為陰性對照（僅 DMSO）。

從 100 μL 液體高度開始，從 Matrigel 孔中吸取 10 μL 培養(yǎng)基在抽吸過程中跟隨液體液位。這不僅可以確保我們不會破壞基質(zhì)膠，而且可以使由于蒸發(fā)（即邊緣孔）導致的培養(yǎng)基損失回歸至與板其余部分相同的體積，因為空氣將被抽吸直至移液管尖的一端達到液體。此體積標準化可確保整添加 10 μL 化合物稀釋液到復孔中后，整個板的化合物最終濃度準確。

凋亡檢測

化合物處理 24 小時后，加入 10 μL CellEvent® Caspase-3/7 Green （Thermo Fisher Scientific） 并培養(yǎng)在 37°C 下孵育 6 小時以對凋亡細胞進行染色。使用 ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集細胞圖像高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（“ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)"，Molecular Devices，圖 2）。孔在 DAPI 和 FITC 濾光片下進行 4X放大。這種較低的放大倍率允許對整個孔進行成像，并通過采集Z-stacks，我們能夠在三維空間中可視化嵌入的細胞，如圖 4A 所示。圖 4B 顯示了對每種誘導劑前 5 種稀釋度的復孔所采集的 zstacks的二維投影。這些投影可用于計算埋于整個2 mm Matrigel 層中的總細胞（藍色細胞核）和caspase陽新細胞（綠色）包，用于確定每種化合物誘導的凋亡的相對水平。

各濃度下caspase陽性細胞的百分比（兩個復孔的平均值）如圖 4C 所示。無論是星孢菌素還是喜樹堿均達到最大毒性，并顯示出傳統(tǒng)的劑量反應曲線，從而允許計算包埋在基質(zhì)膠中的 HCT 116 細胞的 IC50。ICIC50 為 6 nM 的星形孢菌素大約，對HCT 116 細胞的毒性比對喜樹堿的高出10倍，后者 IC50 為 80 nM。5-氟尿嘧啶的作用要弱得多，而在 3.75 μM 的最大濃度達到了50%毒性，其任何 IC50 值都不可靠。這種5-氟尿嘧啶的檢測較弱的效果也見于我們之前對 HCT 116 細胞 3D 模型的研究中。

圖 4. 誘導 Matrigel 包埋培養(yǎng)物的凋亡。A） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集的圖像展示了三維集落，

熒光caspase 3/7 底物作為凋亡的標記物。B） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)以 4X放大倍率采集的 Z-stacks的2D投射后的拼圖。用稀釋的 staurosporine、喜樹堿和 5-氟尿嘧啶（顯示前 5 種稀釋比例），并染色細胞核（藍色）和凋亡（綠色）。C） 每種化合物的成像數(shù)據(jù)生的成劑量-反應曲線。

討論

基質(zhì)膠培養(yǎng)物對于許多研究都非常有價值。同時，我們演示了在 3D-培養(yǎng)的結腸癌細胞中誘導細胞凋亡的化合物篩選，Matrigel 還可應用到其他需要三維空間的檢測，例如血管形成或神經(jīng)突生長的研究。然而，使用 Matrigel 檢測法的挑戰(zhàn)是巨大的。我們已展示了精細控制的移液速度和位置以及溫度調(diào)節(jié)如何使自動化克服了這些障礙。其中一個例子就是自動化如何使這些檢測小型化為384孔板，與手動電鍍或 96 孔板相比，384 孔板型的 Matrigel 使用量減少了 50%，從而節(jié)省了大量成本格式。這種更小的格式也需要更少的染色試劑，并可實現(xiàn)更快的共聚焦成像，因為對于96孔板拉私活捕獲整孔的圖像需要多個視野。

Biomek 工作站的靈活性還可實現(xiàn)多種的工作流程或通量。例如，我們執(zhí)行了在單個 Peltier 位置加熱 Matrigel 檢測板，但如果需要同時處理大量板，可以集成額外的 Peltier 或培養(yǎng)箱。更高通量的應用還可通過集成板和槍頭存儲以及分像帶 MiniMax 細胞計數(shù)儀的 SpectraMax i3X 讀板機或 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)析儀。