膠體金制備注意事項及應用

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一、膠體金的穩定性及免疫膠體金的貯存

膠體金具有很高的動力學穩定性，在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數年不發生凝聚。影響穩定的因素主要有電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。

金溶膠必須有少量電解質作穩定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質能剝去膠粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質反而可增加溶膠穩定性，如蛋白質、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩定效果。

當金溶膠吸附蛋白質后，溶膠的穩定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質的等電點，如ConA，過氧化物酶等，當pH較低時保持穩定，提高pH則顯得不穩定，接近等電點或略高時又變得穩定了。標記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩定劑。在4～10℃貯存數月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發生程度不同的凝聚，可離心除去。

二、制備高質量膠體金的注意事項

（1）玻璃器皿必須*清洗，最好是經過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩定性，不能獲得預期大小的金顆粒。

（2）試劑、水質和環境：劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經超濾或微孔濾膜（0.45µm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。氯金酸極易吸潮，對金屬有強烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其１％水溶液在４℃可穩定數月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少，否則實驗的結果將缺乏重復性。

金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發生改變，應選用緩沖容量足夠大的緩沖系統，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統。但應注意不應使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持數月穩定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。

三、膠體金技術的應用

1、免疫學中的應用

（1）膠體金在電鏡水平的應用

膠體金應用電鏡水平的研究最早，發展最快，應用*泛。其是可以通過應用不同大小的顆粒或結合酶標進行雙重或多重標記。直徑為3～15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標記物。3～15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細胞。

膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：

① 細胞懸液或單層培養中細胞表面抗原的觀察。

② 單層培養中細胞內抗原的檢測。

③ 組織抗原的檢測。

金標記在電鏡水平的應用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負染色、雙標記技術和原位雜交技術等。

實驗證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時適用于科研和診斷。

（2）膠體金在光鏡水平的應用

膠體金同樣可用做光鏡水平的標記物，取代傳統的熒光素、酶等。各種細胞涂片、切片均可應用。主要用于：

① 用單克窿抗體或抗血清檢測細胞懸液或培養的單層細胞的膜表面抗原。

② 檢測培養的單層細胞胞內抗原，

③ 組織中或亞薄切片中抗原的檢測。

膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補其它標記物不可避免的本底過高和內部酶活性干擾等缺點。

（3）膠體金在流式細胞儀中的應用：

應用熒光素標記的抗體，通過流式細胞儀計數分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區分不同的標記困難，因此必須尋找一種非熒光素標記物，用于流式細胞計數。這樣可以同時進行幾種標記。該標記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細胞儀的標記物之一。

（4）凝集試驗：單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當與相應抗原或抗體發生專一性反應后出現凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發生變化，顆粒也會沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應用于免疫反應。

（5）免疫印跡技術(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學技術。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質分離，得到的區帶轉移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、ＲＩＡ）進行定量。

免疫膠體金也可用于該法的定量。轉移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經葡萄球菌Ａ蛋白致敏的膠體金溫育，*洗去多余的膠體金，根據膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。

利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應用已日趨廣泛。

由于膠體金免疫印跡技術簡便、快速，且有相當的高的靈敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應用潛力。

（6）膠體金在肉眼水平的應用

膠體金取代傳統三大標記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點外，還有以下優點：

①試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul；

②不需γ－計數器、熒光顯微鏡、酶標檢測儀等貴重儀器，更適于現場應用；

③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參與；

④實驗結果可以長期保存；

⑤時間大大縮短，提高了檢測速度。

金標過程中，無共價鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質都可被金標記，標記后大分子物質活性不發生改變。實驗結果表明，膠體金的敏感性可達到 ELISA的水平。而結合銀染色時，檢測的敏感性更大大提高。

2、免疫診斷技術中的應用

膠體金標記技術由于標記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應用范圍廣，除應用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細胞術等。

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