激光共焦顯微鏡（Laser Confocal Scanning Microscope，LCSM）是生命科學研究中使用最為廣泛的成像儀器，以下是對其操作與維護的詳細指導：

　　操作步驟

　　1.樣品制備：根據實驗要求制備樣品，樣品制備對成像結果有著直接影響。樣品類型很多，包括細胞、組織切片、微生物、植物以及材料，樣品形式可以是固體也可以是液體。樣品制備好后需要放在耗材上才能在顯微鏡系統下觀察，耗材一般有玻片、細胞爬片、共聚焦小皿以及多孔板等。使用20倍及以上物鏡時，蓋玻片厚度應≤0.17mm，或者專用共聚焦小皿底厚33mm。此外，要注意：

　　激發波長和發射波長需與儀器配備的激光系統和掃描系統的光譜匹配，以確保最佳成像效果。

　　多色成像時，避免選擇波長接近或有交叉重疊的染料，以防止串色。

　　免疫熒光染色操作步驟復雜，對科研人員的手法要求嚴格，在對細胞或組織進行免疫熒光染色時，要注意封閉以及固定的方法，封閉一般使用脫脂牛奶，而固定一般使用甲醇或多聚甲醛；封片時可以加入抗淬滅劑來減弱淬滅。

　　2.開啟儀器：先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設置熒光樣品的激發光波長，選擇相應的濾光鏡組塊，以便光電倍增管（PMT）檢測器能得到足夠的信號結果。

　　3.設置掃描方式：在目視模式下調整所用物鏡放大倍數，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。使用顯微鏡時，一般從低倍鏡開始找視野，找到視野后再切換高倍鏡觀察。根據樣品大小及放大倍數選擇合適物鏡，使成像更清晰，通常情況下，物鏡放大倍數越高，成像視野越小。

　　4.獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。

　　5.獲取三維圖像：激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能，在不損傷細胞的情況下，可以獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack”模式，開啟選項后確定光學切片的位置及層數，再啟動“Start”，即可獲得三維圖像。

　　6.獲取時間序列圖像：共聚焦顯微鏡的“Time-Series”功能可以自動在實驗者規定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數量，開啟“Start T”功能鍵，即可進行實驗。

　　7.關閉儀器：激光共焦顯微鏡測定樣品結束后，先關閉激光器部分，計算機仍可繼續進行圖像和數據處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統，則應在激光器關閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
 

　　維護方法

　　1.環境要求：

　　儀器需有專門的實驗室安放，做到干凈、干燥、防震。

　　室內安裝空調和除濕機，溫度恒定在21℃±1℃（或5~25℃），濕度≤60%，避免陽光直射。

　　儀器周圍要遠離電磁輻射源，環境無震動、無強烈的空氣擾動。

　　室內具有遮光系統，保證熒光樣品不會被外源光漂白。

　　工作人員出入儀器房要換鞋、換實驗服。

　　2.開關機與預熱：注意開機關機的順序及激光管的保護，使用需預熱約半小時，用完機器一定要等風扇停止運轉再關機。

　　3.日常清潔：使用完畢后蓋好防塵罩，并做好儀器表面及內部（如光學部件和機械部件）的清潔工作。光學部件包括物鏡表面、目鏡的上表面、聚光鏡、底座光源出口、目鏡筒內側等；機械部件包括主機架、載物臺。

　　4.存放與防潮：顯微鏡要經常使用，長期不用應將主要光學部件放進防潮缸，潮濕地區的顯微鏡應安放防霉片。

　　5.數據安全：掃描后的圖像及數據嚴禁用軟盤拷貝，以防病毒浸染激光共聚焦顯微鏡系統。

　　通過以上操作和維護步驟，可以確保激光共焦顯微鏡的準確性和穩定性，從而獲取高質量的成像結果。