——高性能Taq酶助力高通量PCR與基因組研究
PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶 是KAPA Biosystems（羅氏診斷旗下品牌）研發的高性能Taq DNA聚合酶，專為高通量PCR、長片段擴增及二代測序（NGS）文庫制備設計。該酶通過直接分子進化平臺優化，具備超高保真性、抗抑制劑能力及擴增長片段DNA的優勢，適用于復雜模板的擴增與基因組學研究。
核心參數：
貨號：PKR2016
規格：100 units/支（可滿足50次50 μL反應）
保存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融
有效期：24個月（未開封）
適用領域：醫療衛生、生物制藥、農業育種、合成生物學等
超高保真性
錯誤率：2.8×10??（通過大規模二代測序驗證），顯著低于野生型Taq酶（1×10??）。
應用場景：適合SNP分型、基因編輯靶點驗證、突變檢測等對保真性要求高的實驗。
抗抑制劑能力
耐受性：可耐受血液、土壤、糞便等樣本中的PCR抑制劑（如腐殖酸、血紅素、肝素）。
優勢：無需復雜樣本預處理，直接用于臨床樣本、環境樣本的擴增。
擴增長片段DNA
最大擴增長度：基因組DNA可達15 kb，質粒DNA或噬菌體DNA可達18 kb。
應用場景：全長cDNA合成、BAC克隆擴增、長片段測序文庫制備。
高通量適配性
反應速度：擴增速度較傳統Taq酶提升30%，適用于96孔板、384孔板自動化操作。
靈敏度：可檢測低至1個拷貝的模板DNA，適用于稀有樣本分析。
試劑與耗材
PKR2016 KAPA第二代基因工程酶（貨號PKR2016）
引物（終濃度100-900 nM）
DNA模板（1 ng–1 μg，根據目標片段長度調整）
PCR緩沖液（含Mg2?，無需額外添加）
無核酸酶水
儀器設置
預變性：95℃ 3分鐘
30-40個循環：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb
終延伸：72℃ 5分鐘
溫度程序：
熒光通道：若結合熒光探針（如FAM、HEX），需選擇兼容的qPCR儀。
反應體系配制（以50 μL體系為例）：
| 成分 | 體積（μL） |
|---|---|
| PKR2016酶（2 U/μL） | 0.5 |
| 10×緩沖液 | 5 |
| dNTPs（2.5 mM） | 4 |
| 正向引物（10 μM） | 1 |
| 反向引物（10 μM） | 1 |
| DNA模板 | 1-100 ng |
| 無核酸酶水 | 補足至50 |
加樣與離心
使用單通道或多通道移液器加樣，避免氣泡。
離心（2000 × g，1分鐘）確保液體沉至管底。
PCR程序
預變性：95℃ 3分鐘
循環：30-40個循環（95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb）
終延伸：72℃ 5分鐘
文庫擴增：
使用PKR2016替代傳統酶，可提高文庫復雜度與覆蓋均一性。
推薦反應體系：25 μL（含10 ng文庫模板）。
質量控制：
通過Qubit或Agilent Bioanalyzer檢測文庫濃度與片段分布。
擴增效率驗證
標準曲線法：計算斜率（-3.32±0.1）確認反應效率（90%-110%）。
熔解曲線分析：單一峰型表明特異性擴增。
長片段擴增驗證
使用λ噬菌體DNA（48.5 kb）測試擴增能力，目標片段長度≥15 kb。
模板預處理
對高GC含量模板（>65%）使用DMSO（5%-10%）或甜菜堿（1-2 M）輔助擴增。
對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，建議使用KAPA FFPE DNA修復試劑盒預處理。
引物設計
引物長度18-25 bp，Tm值58-62℃。
避免二級結構與引物二聚體（使用Primer-BLAST或OligoAnalyzer評估）。
反應條件優化
延伸時間：根據目標片段長度調整（1 kb/分鐘）。
退火溫度：通過梯度PCR確定最佳Tm值（±5℃）。
安全規范
避免反復凍融，分裝后保存于-20℃。
操作時佩戴手套，避免RNA酶污染。
操作細節
移液精度：使用校準后的移液器，誤差<±1%。
加樣順序：先加緩沖液與酶，再加引物和模板，最后加dNTPs與水。
故障排除
無擴增信號：檢查引物質量、模板濃度及反轉錄效率。
非特異性擴增：提高退火溫度或縮短延伸時間。
用戶反饋：
“PKR2016顯著提高了長片段PCR的成功率，擴增效率優于競品。"
“在FFPE樣本中，該酶的抗抑制劑能力顯著減少了優化步驟。"
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