逆轉錄RT-PCR原理:

提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

逆轉錄RT-PCR操作步驟：

一、RNA逆轉錄cDNA（反應體系要20ul）依次加入

1、Oligo（dT）加入1ul。

2、RNA（體積即上一步驟計算出來的）

3、剩下的用無Rnase水補齊共12ul 65℃水浴5min。

二、加入逆轉錄試劑

1、5×Reaction Buffer                4ul

2、Ribolock RNase Inhibiter     1ul

3、10mM Dntp  mix                   2ul

4、RevertAid m-mul URT          1ul

三、設置儀器，按照說明書設置

1、oligodT：42℃  60min

2、逆轉錄：70℃  5min

3、終止：4℃

附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作，后面有說明。

四、PCR cDNA擴增目的基因（反應體系是20ul，不夠用無菌水補齊）

下面的實驗用高壓過的槍頭和普通高壓過的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計算出后，取出放在ep管中。）

1、加樣：①Mix 10ul   ②引物 1ul    ③cDNA和水總計9ul

2、混勻：小離心機甩一下即可

3、放入PCR儀：PCR儀事先設定條件，反應條件根據mix說明書來設定

4、PCR產物保存：一般在4℃冰箱保存，長時間不用可-20℃凍存。

五、配膠和跑膠:

1、配膠: （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。

小膠板8孔的  TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g

中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g

步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準)→將沸騰的液體轉移到EB污染區的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個角倒入防止產生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。

2、跑膠:

（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新換電泳緩沖液。

（2）要讓緩沖液沒過膠。

（3）Marker標記染色體上一個可以被識別的區域，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。

步驟：取PCR產物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負極到正極）,當loading Buffer跑到2/3時停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺上。

六、照相