免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理先將已知抗體標(biāo)上英光素以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光從而可確定組織中某種抗原的定位進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。那實(shí)驗(yàn)背景染色較深的原因有哪些?

1、抗體濃度過高一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

2、抗體孵音時(shí)間過長或溫度較高解決辦法是嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程更好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘及時(shí)提醒避免因遺忘而造成時(shí)間延長。現(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)而是30分鐘因此要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

3、DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長DAB更好現(xiàn)用現(xiàn)配如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長因?yàn)樵跊]有酶的情況下過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色更好在顯微鏡下監(jiān)控達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控避免顯色時(shí)間過長。

4、組織變干修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈可以有效的避免液體流失也能提高操作速度。

5、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(大于24小時(shí))原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前將切片脫蠟至修復(fù)第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在40C冰箱過夜對結(jié)果無明顯影響如果放在室溫特別是炎熱的夏天會出現(xiàn)背景著色因此，不可存放時(shí)間太長。

6、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克降抗體注意抗體的有效期過期的抗體要么不昂色要么背暑著色，用新買抗體時(shí)更好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。