實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板的定性及定量分析。

 

1.在qPCR 技術中重要的參數指標有哪些？

   擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環數為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態進程；溶解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，溶解曲線就會出現單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個峰。

 

  熒光域值（threshold）: 是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。

 

  Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線性關系，可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標準曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

2.擴增曲線一般分為哪幾個階段：

  熒光擴增曲線一般分為基線期、指數增長期和平臺期。在qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，此時即為基線期，

 

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數形式增加的，隨著反應循環數的增加，zui終PCR反應不再以指數形式生成模板，從而進入平臺期，在該時期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，只有在熒光信號的指數增長期，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

3.ROX染料的作用

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應，熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學因素（液滴、氣泡）的因素，反應體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進行歸一化校正，以提高數據的較精確度。

 

4.Ct值多少才算理想

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是的，需要輔以溶解曲線加以解釋。