操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.加樣：分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μL，標準品孔分別加入依次梯度稀釋標準品，待測樣品孔加待測樣品100μL，給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。立即每孔加入配好的生物素標記的抗IL-6蛋白抗體工作液100μL（在使用前15 分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

3.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；

4.立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前15分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育45分鐘;

5.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；

6.每孔加TMB底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。

7.每孔加終止液100μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。

8.立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

9.實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。

注意事項：

1.保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染，否則可能會出現錯誤的結果。

2.酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔。

4.溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。

6.顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數。

7.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

8.混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

9.安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家生物試驗室安全防護條例執行。

10.不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）

11.試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！