顯微課堂 | 如何形成清晰的圖像

DIN/ISO標(biāo)準(zhǔn)將物體側(cè)面的景深定義為“物體平面兩側(cè)空間的軸向深度，物在該深度范圍內(nèi)移動(dòng)時(shí)沒(méi)有可檢測(cè)到的圖像清晰度損失，且圖像平面和物鏡的位置保持不變"。

然而，該標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有給出任何關(guān)于焦點(diǎn)虛化檢測(cè)閾值的測(cè)量方法。Max Berek是就人眼景深發(fā)表文章的作者，早在1927年，他就已經(jīng)將自己通過(guò)廣泛實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果公布于世。Berek公式給出了人眼景深的實(shí)際值，至今仍在沿用。簡(jiǎn)化公式如下：

TVIS = n [λ/(2 × NA2) + 340 μm/(NA × MTOT VIS)]

在放大率低時(shí)，縮小光圈（即減小數(shù)值孔徑）可以顯著延長(zhǎng)景深。一般可用孔徑光闌或共軛平面上的光闌來(lái)完成這一操作。但數(shù)值孔徑越小，橫向分辨率越低。

因此，問(wèn)題在于如何根據(jù)物體結(jié)構(gòu)找到分辨率和景深之間的最佳平衡點(diǎn)。借助高分辨率物鏡（高NA）和可調(diào)孔徑光闌，現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡能夠根據(jù)特定樣品的要求靈活匹配光學(xué)器件。在體視顯微鏡中，考慮到三維結(jié)構(gòu)中z維度的要求，通常需要作出一些妥協(xié)以獲得更大景深。

Leica Microsystems采用了一種復(fù)雜的光學(xué)方法來(lái)消除體視顯微鏡中分辨率和景深之間的相關(guān)性，這種方法就是FusionOptics™。該設(shè)備提供了一條光路方便觀察者單眼觀察分辨率高但景深短的圖像。另一只眼可通過(guò)第二條光路觀察到同一物體，但此時(shí)分辨率低而景深長(zhǎng)。

人腦將兩個(gè)獨(dú)立的圖像組合成一個(gè)最佳的整體圖像，即同時(shí)具有高分辨率和長(zhǎng)景深的特征。

還有一個(gè)示例也闡明了人腦的非凡能力，即Greenough體視顯微鏡。在這個(gè)顯微鏡中，左光路和右光路中的物體平面之間存在微小角度。在整個(gè)圖像中，整個(gè)陰影區(qū)域看起來(lái)是清晰聚焦的，但左圖像或右圖像中的并非如此。

圖2：具有景深范圍的Greenough體視顯微鏡中的物體平面

Leica應(yīng)用程序組（LAS X）的多聚焦模塊旨在多次通過(guò)多次聚焦來(lái)增加自動(dòng)顯微鏡的景深。用戶可以單獨(dú)設(shè)置照明、圖像亮度和所有其他相機(jī)參數(shù)，以優(yōu)化所獲圖像的質(zhì)量。

利用LAS X多聚焦模塊，在顯微鏡和主動(dòng)對(duì)焦的一體化控制下，可以輕松捕獲具有更大景深的實(shí)時(shí)圖像。z堆棧的自動(dòng)捕獲以及智能圖像組合算法確保可以輕松拍攝并存儲(chǔ)清晰的聚焦圖像。

由于存在自動(dòng)化處理例行程序，用戶幾乎無(wú)需干預(yù)。可針對(duì)各種樣品輕松更改此類設(shè)置。多聚焦模塊適用于材料科學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及生物和地球科學(xué)方面的應(yīng)用程序。