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單克隆篩選利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選
閱讀：491 發(fā)布時間：2020-7-14
單克隆篩選在穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建實驗中，部分外源基因能夠通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并通過分子間重組，整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體，不同外源基因整合位點不同，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會表達(dá)。
想要獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，需要對轉(zhuǎn)染后得到的細(xì)胞池進(jìn)行陽性克隆篩選，如果想要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞株，還需要進(jìn)行單克隆篩選。原理：細(xì)胞池篩選系統(tǒng)可以分為非基因擴(kuò)增選擇系統(tǒng)與基因擴(kuò)增選擇系統(tǒng)兩種。基因擴(kuò)增選擇系統(tǒng)及GS系統(tǒng)常用。
轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的質(zhì)粒帶有某種選擇性標(biāo)記（例如代謝標(biāo)記、抗生素標(biāo)記等），將帶有標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或轉(zhuǎn)染位點不合適的宿主細(xì)胞會因為缺乏選擇標(biāo)記，無法在選擇培養(yǎng)基上生長而死亡，成功轉(zhuǎn)染的陽性克隆可以在選擇培養(yǎng)基上生長，從而達(dá)到篩選陽性克隆的目的。
在擴(kuò)增選擇系統(tǒng)中，還會對轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞施加相應(yīng)的選擇壓力，只有外源基因表達(dá)水平高的細(xì)胞株才可以存活，從而篩選得到高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。單克隆篩選可通過干擾核糖體功能來阻止哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，因此哺乳動物細(xì)胞無法在培養(yǎng)基上生長。將帶有抗性基因（抗生素標(biāo)記）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞，如果基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組中合適的地方，選擇培養(yǎng)基中正常生長，而沒有成功整合抗性基因的細(xì)胞則會死亡，從而達(dá)到篩選陽性克隆的目的。