圖1：免疫系統細胞分化圖

表1：不同底物輸送給原代免疫細胞的優缺點綜述

通過病毒轉導，可以將感興趣的基因整合到宿主基因組中。常用的是慢病毒載體，慢病毒載體尚不能將目的基因插入到特定位點而是隨機插入。

一種將底物遞送到人體免疫細胞的便捷技術是Nucleofector^TM技術，這是一種改進的電穿孔技術。的Nucleofector^TM解決方案與針對特定細胞類型優化的電轉參數相結合，使研究人員能夠實現高轉染效率和良好的存活率。底物直接輸送到細胞質和細胞核。小化的免疫原性保留了免疫細胞的功能(圖2)。

Nucleofector^TM技術不僅了效率和可行性。考慮到表達CAR的T細胞^[4]和NK細胞^[5]以及基因組編輯^[6]，不同底物的共轉染也是可以簡單的實現-在大小和底物類型上具有很大的靈活性，如DNA、RNA和蛋白質。

通過使用4D-Nucleofector^TM技術，實現封閉和可擴展的轉染應用。它可以很容易地從用于基礎研究或篩選目的的20-100ul小規模體系到高達20ml的后續應用，例如用于細胞治療的體外修飾。

不管底物遞送的方法是什么，免疫細胞在轉染前的狀態決定了之后細胞的活性和功能。細胞對轉染過程的反應有多強烈或敏感，一方面取決于分離過程，另一方面也存在供體特性的問題。

能夠獲得血液或骨髓樣本以自我分離免疫細胞的研究人員，應確保遵守既定的分離、刺激免疫細胞的標準操作程序。嚴格按照說明操作將產生可比較和可重現的結果。

如果無法獲得這種來源，研究人員就會利用商業上可獲得的造血細胞和免疫細胞進行研究。這有利于在質量控制和優化培養系統方面的工作。

然而，無論細胞的來源是什么，原代細胞都是來自單個有機體的細胞。捐贈者特定的差異是不可避免的，并將導致結果差異^[7]。

對于病毒轉導來說，病毒顆粒的制備是復雜的，而用于改良電穿孔的底物選擇則更加多樣化。

為了確保的條件，底物應該是高質量的。當我們選擇質粒DNA進行基因遞送時，有許多需要考慮的方面，關于載體DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

底物的大小和濃度是這個游戲中的額外玩家。底物大小本身通常不是影響轉染效率的主要因素，但當質粒大小超過約15kb時，效率會有所下降。因此，在轉染較大的質粒時更要考慮實驗所需的DNA量和質粒的完整性。增加每個反應的DNA含量通常會提高轉染效率，但由于高濃度的DNA可能會對細胞產生毒性，細胞存活率可能會降低。對于Nucleofection實驗，的底物濃度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之間。

                                     表2：人類原代免疫細胞Nucleofection條件、結果和參考文                                           獻(OP：optimized protocol可用的優化方案，IHD：in-house data基于內部數據)

1 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering

2 Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques

3 Nucleofection – Combining High Transfection Performance with Superior Preservation of Functionality

4 A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19

5 Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications

6 A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors

7 Human immune system variation

8 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells

9 Alterations in Cholesterol Metabolism Restrict HIV-1 Trans Infection in Nonprogressors

10 Altered expression of miR-181a and miR-146a does not change the expression of surface NCRs in human NK cells

11 Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo

12 Characterization of Programmed Death-1 Homologue-1 (PD-1H) Expression and Function in normal and HIV Infected Individuals

13 IL-27 inhibits HIV-1 infection in human macrophages by down-regulating host factor SPTBN1 during monocyte to macrophage differentiation

14 Generation of multivirus-specific T cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant