隨著技術的，內毒素檢測方法也從初的兔熱原檢測法（RPT）發展到鱟試劑檢測法(LAL/TAL)，再到如今的重組因子C(rFc)法，經歷了從體內到體外，從少量到通量，從緩慢到快速的逐步發展更替，來不斷滿足行業發展的需求。

圖1內毒素檢測方法發展史

近年來，重組C因子內毒素檢測法以其快速、簡單、非動物源等特點受到越來越多的關注，有望替代鱟試劑，成為內毒素檢測的主要方法。我們將從4個方面論述了這一替代趨勢的必然性：

• 從原理角度看，LAL和rFC都能用于內毒素檢測

• 重組生物技術的發展必然帶來檢測方法的革新

• 對rFc檢測法在應用中所面臨的阻力的深度理解

• 對rFC法接受度的逐步增長及法規和監管狀態加持

圖2rFC重組因子檢測法應用的四大支柱

1）LAL既定效用；2）重組技術的發展；3）對面臨阻力的深度理解；4）接受度的逐步增長

從工作原理上看，LAL和rFC都能用于內毒素檢測

從原理上看，rFC方法的發明是基于對鱟試劑法內毒素檢測的級聯反應的通路理解。生物化學家表征了鱟凝血級聯中的蛋白質成分，系其血細胞和變形細胞中的一系列絲氨酸蛋白酶（C因子、B因子、G因子和凝固酶原、凝固蛋白原）[1-2]，這些絲氨酸蛋白酶負責在內毒素存在時的鱟血液凝固（圖3），為行業內從凝膠法檢測發展到動態濁度法、動態顯色法，之后發展到rFC方法提供了科學依據。同時，標準品CSE/RSE和標準的建立也為包括rFC方法的定量檢測打好了良好基礎。

圖3鱟試劑內毒素檢測原理

重組生物技術的發展必然帶來檢測方法的革新

自1982年，禮來公司生產出了個商業化重組人胰島素Humulin®以來，越來越多的治療性大分子被開發，也給生物技術行業帶來了一股新的力量。多年來，科學家一直在試圖生產出一種可持續、環保、經濟的人工合成內毒素識別因子,保護鱟資源。

隨著對凝血級聯酶的認知不斷積累，科學家們對內毒素敏感的絲氨酸蛋白酶因子C進行了基因工程改造。從開始了解C因子的生化性質，到使用分子生物學技術進行克隆，并在各種宿主（細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞）中表達全功能重組因子C蛋白，歷經了15年[3-5]，終確定重組C因子(rFC)的多功能結構域，使其成為一種具有酶活性的前體，識別和結合內毒素后表現出催化活性。

rFc法只需一步即可酶切熒光底物產生熒光，并根據底物酶切的量來反饋內毒素含量，符合實驗動物的3R原則：減少，替換，優化，以及第四個“R”原則，即內毒素檢測的重現性。因此，采用rFC代替LAL的優勢是顯而易見的。

對rFC檢測法在應用中所面臨阻力的深度理解

圖4內毒素檢測方法及原理 rFC是單組分，單步驟敏感特異的內毒素檢測方法

在生物醫藥領域，藥品和診斷產品受到高度監管，采用可靠的LAL內毒素檢測替代方法，例如rFc方法，對水、原材料和過程樣品的測試都非常重要，因為替代方法的使用可以大約節約90%的鱟試劑使用。近半個世紀以來，盡管LAL檢測也存在一些問題，制藥公司和醫療保健行業仍在很大程度上依賴于LAL，直到2004年，rFC方法才商業化。

但是，從RPT到LAL，從LAL到rFC，內毒素檢測方法的更替都是基于行業發展的需求，縱觀歷史，都需要一定的時間，需要行業的反復論證和實踐檢驗。

迄今為止，rFC檢測方法認可度也算是在逐漸提高，也是一種久經考驗的LAL檢測補充或替代方法。不僅僅具有“3S”優勢Scientific characterization（可靠）、Sensitivity（靈敏）和Specificity（特異），還具有易于被大規模、批量、自動化生產，批間一致性有保障，不受G因子旁路干擾等特點，更有利于制藥公司獲得、可靠檢測結果。

rFC的未來之路——法規和監管狀態（美國、歐盟、中國）

多年來，科學家們一直設想將鱟的先天免疫研究結果應用于生物技術、制藥和人類保健行業。C因子和許多其他進化保守的分子已被確定為在免疫防御、抗菌作用和治療敗血癥方面具有實用性，LAL也應該重點用于拯救生命和提高生活質量的分子研究[6-7]。基于rFC的內毒素檢測的應用已得到研究應用的支持，緩解了潔凈技術中對鱟的需求。禮來公司采用rFC 進行藥物質量控制，其中四個已成功獲得FDA的認可，證明了rFC用于注射藥物安全性檢測的可靠性和價值[8-9]。

從資源可及性角度看，鱟的持續捕撈也非常不明智，它會給整個醫藥產品供應鏈帶來風險。很多科學家也在努力促進使用合成rFC代替LAL，以保護鱟免于滅絕，加速了rFC作為藥典試驗的采用。隨著制藥行業發展，越來越多法規許可rFC作為LAL方法的替代方法（表1）。目前有超過100家生產公司在使用rFC方法用于質控，以實現高效的過程生產和質量。

 

Lonza是被授權生產rFC因子的廠商，其中PyroGene重組因子試劑盒已被多家藥企使用。一項 多中心研究顯示，使用PyroGene從水和其它測試產品中回收內毒素與基于LAL的方法相當。試劑盒驗證的結果發表在藥典論壇36[1]卷（2010年1月-2月）。

自1970年至今半個世紀以來，Lonza作為較早期開發內毒素檢測產品的公司，為客戶提供包括細菌內毒素檢測試劑盒、內毒素檢測軟件、內毒素檢測酶標儀在內的一站式解決方案，符合FDA21CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規要求，已用于國外藥物的放行，滿足出口型/雙報制藥企業的規模化內毒素測定需求。