單細胞分泌（功能）蛋白質組學技術揭示了同時分泌多種細胞因子的少數高度多功能細胞亞群（subsets of highly-polyfunctional cells），這些超級細胞可以預測患者在體內的反應和疾病進展，負責協調免疫反應和加速先進治療藥物的開發。

目前最被關注的腫瘤免疫治療方法包括以PD-1/PD-L1抗體為代表的免疫檢查點抑制劑療法、以CAR-T為代表的細胞免疫療法、腫瘤疫苗以及小分子抑制劑等新興免疫療法。近年來，大量以免疫單藥及聯合治療的臨床研究在國內外陸續開展，取得了多項令人振奮的結果，腫瘤免疫治療生物標記物在治療和預后預測中也展現出相當的潛力。然而，免疫療法的作用機制比我們想象的更為復雜，受益群體相對有限，大多情況下只有少部分癌癥患者能夠從中獲益，PD-L1表達、腫瘤突變負荷（TMB）、高度微衛星不穩定（MSI-H）等生物標志物無法滿足臨床需求，亟需探索更好的生物標志物
 

單細胞分泌蛋白組學興起

免疫細胞在抗腫瘤、抗感染等免疫應答中發揮重要作用，細胞因子就像免疫細胞的工具，可以幫助免疫細胞有效對抗“敵人"，抵御和清除腫瘤及自身損傷細胞。不同細胞因子表現出廣泛的多效性，以協調先天性和適應性免疫系統，通過分析免疫細胞產生的細胞因子，可以幫助分析和評估細胞的免疫功能。有些免疫細胞不僅分泌一種細胞因子，可能分泌兩種、三種、四種或以上，可分泌兩種及以上細胞因子的細胞稱為“多功能細胞"（polyfunctional cells或multifunctional cells），在過去的十多年有很多研究發現，這群細胞比只分泌一種細胞因子的細胞（單功能細胞）的功能更強，在體內產生的免疫應答更有效更持久。

傳統的細胞因子檢測技術，如ELISA、流式微球分析（CBA，Cytometric Bead Array）、芯片多因子檢測等都是檢測血清或細胞培養上清中群體細胞的平均蛋白信號，不能區分這些因子是由哪些細胞分泌的，也無法分辨單細胞分泌多種因子的多能性及共分泌的協同效應，掩蓋了細胞分泌功能的異質性。因此單個因子的檢測濃度高低，往往不能很好預測患者免疫治療的療效。

IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學技術開創性地實現了單細胞水平對直接發揮功能的活細胞分泌蛋白組進行全自動檢測，通過微流控芯片捕獲單細胞、進行活細胞培養、逐一檢測每個單細胞分泌的多達32種細胞因子，通過生信軟件自動數據分析和可視化。對比分析免疫細胞亞群的細胞因子分泌差異，將不同細胞因子種類和信號強度關聯到相應細胞功能，研究免疫細胞亞群功能異質性和多功能性，找到在免疫應答反應中具有作戰能力的“超級英雄細胞"，并生成特別的“細胞多功能指數（PSI）"，更全面地分析免疫細胞的綜合功能。單細胞功能蛋白質組學技術，成為免疫治療研究中生物標志物探索的有利新工具。

IsoCode 單細胞適應性免疫應答panel

單細胞分泌蛋白組學提供的數據

以德克薩斯大學MD安德森癌癥中心Adi Diab等發表在Journal of Clinical Oncology的文章為例：在BEMPEG（改造的偏向性IL-2受體激動劑）+ Nivo（PD-1單抗）聯合治療轉移性黑色素瘤II期臨床研究中，研究者在用藥前后不同周期采集患者外周血PBMC，通過IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學技術檢測CD4+T、CD8+T細胞的細胞因子分泌譜，包括發揮免疫效應功能、免疫刺激作用、趨化作用、免疫調節、炎癥相關功能的五大職能32種細胞因子的檢測分析。回顧性分析與患者預后和療效相關的生物標志物，包括：

• 應答組和非應答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞分泌因子差異分析；

  治療一周后，應答組細胞因子分泌多樣性更高，多因子組合的分泌頻率更高（橫向條塊顏色越深，比例越高），主要由具有效應功能的細胞因子所驅動，其他趨化性、刺激性和調節性細胞因子也有不同程度的貢獻；

CD8+T細胞分泌因子譜多功能熱圖

• 根據細胞因子分泌差異，分析應答組和非應答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞多功能性（可分泌多種因子的細胞占比）；

  治療一周后，應答組多功能性CD8+T細胞增多；

CD8+T多功能細胞比例

• 分析應答組和非應答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞多功能指數（結合多功能細胞比例及其分泌的各種因子的信號強度）；

  治療緩解組（CR+PR）患者的CD8+ T細胞的PSI升高約2.2倍，具有顯著差異（P＜0.01）；

CD8+T單細胞多功能指數（PSI）

細胞多功能指數（PSI），是結合多功能細胞比例及其分泌的各種因子的信號強度的綜合評價指標。

• 治療后與基線樣本配對分析，外周血免疫細胞PSI中值變化倍數（PSD）；

  CD8+T細胞PSD與客觀緩解率（ORR）顯著相關，可成為與患者應答呈正相關的預測性血液生物標志物；

• 長期隨訪，分析PSD（ PSI中值變化倍數）與患者無進展生存期（PFS）的關系；

  在為期3年的研究過程中，CD8+T細胞PSD高的患者表現出更好的遠期預后效果，或治療結果改善。

本研究證明了BEMPEG + Nivo聯合免疫療法治療轉移性黑色素瘤的有效性和安全性，IsoPlexis的細胞多功能指數（PSI）及其變化倍數（PSD）是有效預測患者總體緩解率的關鍵指標。

IsoPlexis平臺分析的預測性血液生物標志物，使研究人員能夠比以前的傳統技術更早地評估患者對Nivo/Bempeg治療的反應。加速對難治性癌癥的洞察，如轉移性黑素瘤，鑒別與患者持久反應相關的治療。

IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學技術，正在被越來越多的研究者選擇，在腫瘤免疫療法開發和臨床研究中，幫助研究者進行相關生物標記物的檢測分析，揭示患者臨床獲益或耐藥相關的機制，以更好地實現精準治療從而選擇最為適合的治療方案。

IsoPlexis在腫瘤免疫臨床

和臨床前研究中的代表文獻