線粒體是為細胞提供維持其在人體內特定功能所需能量的重要結構，它們作為通過氧化磷酸化產生ATP的關鍵位點影響著能量代謝和穩態，線粒體功能障礙對人類許多疾病都有著重大影響例如復雜的神經系統疾病

作為動態細胞器的線粒體會經歷分裂和融合、在神經元軸突內運動和解體(線粒體自噬)的協調循環，這些動態變化對于能量轉換和神經元存活至關重要。因此，了解線粒體動力學的變化非常有助于開發以線粒體為基礎的治療方案以治療復雜的病變?？焖賱討B活細胞成像與高內涵篩選相結合，是實時大規模定量跟蹤這些變化的一種有效方案。本應用展示了如何使用高內涵細胞成像分析系統Operetta@ CLS研究人類iPSC衍生神經元的線粒體動態變化。

一，細胞培養

對NeuroSight-S人hiPSC衍生神經元進行解凍、鋪板和培養。在包被好的PhenoPlate 384微孔板中每孔接種12000個細胞，培養6天后神經元細胞形成連續生長的軸突網絡。

二，化合物準備與細胞染色

用培養基稀釋化合物（FCCP、Glutamate）并儲存在StorPlate 384 V-bottom微孔板中（每孔75µl）。細胞用10nM PhenoVue 551線粒體染色劑染色20分鐘，隨后在第一次圖像采集前用50µl維持培養基洗滌一次。

三，圖像采集設置

使用Operetta CLS進行活細胞成像，共聚焦模式，40x水鏡，圖像輸出binning 3。這種拍攝組合使得PhenoVue 551通道能夠以低激發功率和短采集時間成像，這是確保線粒體在受到最小的光毒性/漂白作用下仍然有足夠強的信號和良好分辨率的最佳折衷方案。

熒光通道包括PhenoVue 551（PV）和Brightfield（BF），每個通道都可以單獨定義幀速以及時間點數量。PV通道以每秒2幀（fps）的速度（每孔）采集50個時間點的圖像。BF通道主要用于神經元網絡結構識別參考，因此被設置為第二通道組，每孔僅采集一個時間點的圖像。

四，化合物處理及成像

在細胞染色之后即對孔板進行第一次成像以建立每孔的初始線粒體動態狀態基線。然后細胞用20µM Glutamate、1µM FCCP、2.5µM FCCC或對照培養基進行處理，隨后再對細胞進行成像。

圖一. 線粒體動態分數檢測工作流程

五，圖像分析

使用Harmony®軟件分析時間序列圖像，以評估隨時間變化的動態線粒體分數。為了準確識別線粒體，第一步，用明場圖像識別神經元網絡區域；第二步，在神經元網絡區域中通過PhenoVue 551通道去除細胞體區域，并在剩下的區域中進行線粒體分割。動態線粒體分數則定義為相鄰時間點線粒體面積（像素）的差值。最終輸出結果為每個時間點的動態線粒體分數與所有線粒體的面積比，這個比值代表了給定時間范圍內的線粒體動態（圖二）。數據結果表明在整個實驗過程中線粒體動態分數是穩定的，證明了圖像采集條件的有效性。

圖二. 用于評估線粒體隨時間動態的Harmony軟件中的圖像分析步驟

進一步對加藥組進行圖像分析，根據第一次基線測量建立的時間序列面積比平均值計算相對線粒體運動（圖三），數據結果表明在5至45分鐘的時間內藥物作用對線粒體運動的影響都相當穩定，谷氨酸處理未顯示線粒體相對運動的顯著變化。而經FCCP處理后線粒體的相對運動顯著下降。

圖三. 線粒體動態計算結果

結論：

了解線粒體功能的病理變化對于開發基于線粒體的治療方案以治療復雜疾病（如癌癥、神經疾病和代謝綜合征）至關重要。本應用展示了如何使用Operetta CLS高內涵活細胞成像分析系統研究人iPSC衍生神經元的線粒體動力學。利用PhenoVue 551線粒體染色與低光毒性、高分辨率成像相結合，可以在不損害線粒體功能的情況下在長達1小時的時間內檢測線粒體變化，建立高通量成像方法來分析神經元中線粒體的動力學變化。實驗結果表明活細胞成像與高通量篩選相結合是實時、大規模分析線粒體動力學的一種有效方案。