抗體工程的最新進展開啟了免疫治療的新篇章，導致了具有穩定性、特異性和治療潛力的雙特異性抗體(bsAb) 的開發。由于工程化雙抗擁有兩個不同的抗原結合臂，致使雙抗的的生產變成了一個復雜且具有挑戰性的過程。具體挑戰包括：正確的鏈配對、同源二聚體污染、產量、正確的蛋白質折疊和翻譯后修飾。以抗體設計為主導的解決方案和創新工藝技術的結合使得克服其中許多挑戰成為可能，雙抗生產的復雜過程需要強大且可靠的表達平臺，包括：

”

表達載體：

理想表達載體將目標分子所有鏈以高比例進行基因組整合和表達。盡管多表達盒載體可以提供便利，但將雙特異性抗體的每一半引入單獨的載體中，微調它們各自的表達水平亦可實現配對。

細胞系：

工程化雙特異性抗體的表達需要強大的宿主細胞系，廣泛使用的為中國倉鼠卵巢細胞CHO，因為它不僅需要有效的鏈配對，還需要正確的翻譯后修飾、折疊和分泌。

早期質量篩選：

細胞池和克隆篩選過程中的早期質量分析有助于評估鏈配對效率、折疊模式和潛在的聚集風險。

工藝優化：

即使使用優化的細胞系和載體，同源二聚化仍然是雙特異性生產的潛在障礙。通過優化細胞培養過程和純化策略，提高所需分子的產量。

瑞孚迪（Revvity）的CHOSOURCE™蛋白表達平臺可以幫助實現高效雙特異性抗體的生產(圖1)。這一全面的解決方案匯集了強大的CHOSOURCE平臺上谷氨酰胺合成酶敲除 (GS KO) 的CHO細胞和ADCC+宿主細胞系轉座子載體技術，用于目標分子完整高效的基因組整合，顯著優化細胞系開發 (CLD) 流程，提升雙抗的表達和配對。此外，瑞孚迪的微流控毛細管電泳分析系統LabChip®GXII Touch™實現了快速的蛋白關鍵質量屬性分析(純度，糖型，電荷異構性等)，將質量分析納入生物治療工作流程早期，從而顯著提高細胞株構建 (CLD) 效率和質量控制。

圖1：CHOSOURCE蛋白平臺和CHOSOURCE 轉座子技術. 轉座子技術是一個由轉座子載體和轉座酶mRNA組成的雙組分系統。轉座子載體本身含2個表達盒。目標基因(GOIs)克隆至載體后，轉座酶通過識別載體上的末端反向重復序列(TIR)，將含有GOIs(包括GS選擇盒)的序列整合到宿主細胞基因組中，實現目標基因的高效完整整合。

實驗設計

不對稱4鏈雙特異性抗體，由兩條輕鏈(LC1和LC2)和兩條重鏈(HC1和HC2)組成，采用knobs-into-holes結構(圖2)。CHOSOURCE 轉座子技術由雙表達盒轉座子載體和轉座酶兩部分組成，因4鏈分子的表達需要2個載體，通過四條序列在2個載體上的不同配組得到8種載體和組合(圖3)，兩載體間以1:1比例同轉座酶mRNA共轉染至GS KO CHO宿主細胞中。

圖2：使用CHOSOURCE 轉座子技術表達具有knobs-into-holes Fc區域的不對稱4-鏈雙特異性抗體[A]。正確的異二聚體抗體[A]會與一些不正確的鏈組合和自由鏈[B]共同表達，雜質種類復雜。

Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC1;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC2

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Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC2;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC1

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Vector1:MCS1-LC2,MCS2-HC1;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC1

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圖3：使用 CHOSOURCE 載體表達4鏈雙特異性抗體，兩個轉座子載體與轉座酶mRNA共轉染GS KO的CHO 細胞。圖示本測試中構建的8個不同的載體，8種不同轉染組合下的各載體的配組情況。

實驗結果

細胞池篩選恢復和整合拷貝數分析

轉染后無需選擇劑甲硫氨酸亞砜亞胺(MSX)，6個組合的細胞池在8~13天完成篩選恢復，2個恢復慢的組合在16天達到培養階段(圖4)?；謴蜁r間的差距表明每個載體內的抗體鏈位置對細胞池的選擇恢復有影響，這可能是由于不同位置的抗體鏈的表達水平不同。

圖4：共轉染后細胞池的選擇恢復概況。圖(A)代表活細胞密度，圖(B)代表活力百分比。誤差線代表兩個獨立轉染細胞池的標準偏差。

評估每個細胞池中載體的整合情況(圖5)，我們發現同一表達載體中的HC和LC及GS基因以1:1:1的比例整合到每個細胞池中。例如，在共轉染條件3中，載體1中LC1和HC1確定的拷貝數均為15，載體2中HC2和LC2確定的拷貝數為11，它們組合起來與觀察到的GS基因的26個拷貝相匹配。8個pool中GS 基因拷貝數基本等于兩個重鏈或輕鏈的所在載體拷貝數之和，同以往的實驗結果相一致，說明了轉座酶介導完整的轉座。

圖5：目標基因拷貝數插入情況。篩選恢復后每個共轉染組合條件下細胞池中四條目標抗體序列(LC1、HC1、LC2、HC2)和篩選基因GS的插入拷貝數檢測 (ddPCR方法，每個樣本三次重復)。

由于兩載體以1:1的比例共轉染，預計每個庫中會整合相同數量的四個鏈拷貝。結果顯示：共轉染條件4、7和8下，所有四個鏈的數量幾乎相等；在其他條件下，并非以1:1的比例進行。例如，在共轉染條件1中，含有“knobs”HC (HC2) 的載體比含有“holes”HC (HC1) 的載體整合更少的拷貝數(大約一半)。這可能是由于較高的“旋鈕”HC整合可能會導致“旋鈕-旋鈕”同二聚體的產生增加，這些二聚體會導致細胞死亡。

細胞池生產力和質量評估

恢復后的8組測試細胞池經14天的未優化的fed-batch培養，初步評估哪個組合配置產能有優勢。雙抗的產量數據顯示：具有相似拷貝數的六個共轉染池的抗體產量在相同范圍內，并且高于1g/L，而其余兩個池拷貝數最少，產量也較低(圖6)。“LC1HC1_HC2LC2”(共轉染條件3)配置具有最高數量的整合拷貝，產生了最高的總體抗體滴度。

圖6：八個共轉染細胞池的雙抗生產力初步評估（14天fed-batch培養）。

使用微流控毛細管電泳LabChip GXII Touch HT系統，利用ProteinEXact試劑盒進行八組載體配置下純化抗體的非還原和還原電泳分析，并與參考雙特異性抗體進行比較(圖7，圖8)。微流控毛細管電泳技術可以可以根據蛋白質的大小，高效分離非還原樣品的不同構象，如異二聚體、同二聚體、糖基化和非糖基化變體以及游離鏈等，對于分析還原樣品，可以實現單個抗體鏈的鑒定和定量。

比較八個載體配置下蛋白電泳圖譜發現（圖7），雖然“LC1HC1_HC2LC2”(共轉染條件3)具有最高的抗體滴度，但表達的抗體譜與參考分子不同。共轉染生成該池的兩個載體內兩條重鏈和輕鏈的前后位置導致LC2鏈表達減少，這可能妨礙了分子的正確組裝。結合還原蛋白電泳圖譜，“LC2HC1_LC1HC2”(共轉染條件8)顯示出更多優勢，不僅峰型與對照分子相近，四個抗體鏈的存在比例與參考分子的比例也非常相似。

圖7：LabChip GXII Touch HT系統評估8個配組組合及參考雙抗的非還原和還原狀態下蛋白的μCE-SDS情況。非還原蛋白樣品的電泳圖譜如[A]所示。還原蛋白樣品的電泳圖譜見[B]圖，條形圖代表各條鏈的濃度百分比(%)。

細致分析“LC2HC1_LC1HC2”(共轉染條件8)產生的抗體異構體與參比分子的異同（圖8），雖然其表達滴度比條件3稍低(1.2g/Lvs1.4g/L)，但構象正確率達到94%。產量和質量評估對于確定細胞系開發流程中最佳細胞池同樣重要。

圖8：對于LC2HC1_LC1HC2(共轉染條件8)樣本抗體，微流控毛細管電泳中的各個峰相對于參考雙抗分子的細分分析。[A，B]非還原蛋白質的各峰比較，[C，D]還原蛋白的各峰比較。

本研究只是測定了兩種載體以1:1的共轉染比例產生的正確抗體構型的情況，由于雙特異性抗體的基因組整合和表達的動力學的復雜性，兩個載體還可以嘗試以不同的比例共轉染以產生更佳的正確的異二聚體配置。

結論

在這項工作中，我們使用CHOSOURCE 轉座子載體技術表達不對稱4鏈雙特異性抗體。獲得高表達且正確的異二聚體構象是雙抗生產的目標。CHOSOURCE 轉座子技術雙盒載體提供了調節雙特異性抗體不同鏈表達的靈活性。這不僅可以通過測試兩個載體不同比例的共轉染來實現，還可以通過測試不同的鏈位置來實現。CHOSOURCE 轉座子技術搭載GS KO細胞系，能夠在轉染后約6周內評估細胞池階段的蛋白質質量，鑒于轉座子帶來的完整高效整合，有助于高效實現CLD的開發。

雙特異性抗體分子設計的進步，例如knobs-into-holes結構，顯著減少了錯配和同源二聚體污染。然而，“孔-孔”同二聚體和共純化的游離鏈仍然存在挑戰，故在細胞系開發過程的早期納入質量分析變得很關鍵。瑞孚迪的微流控毛細管電泳LabChip GXII Touch HT系統可用于進一步提高生物制劑開發的速度。在本研究中，LabChip GXII Touch HT系統可以快速檢測細胞池表達的抗體表征。將非還原和還原的抗體圖譜與參考分子進行直接比較，能夠在細胞系開發時及早識別最佳的細胞池。

總之，瑞孚迪的CHOSOURCE表達平臺和LabChip GXII Touch HT系統的強強聯手，可以大程度的簡化和加速復雜分子的細胞系開發過程，促進生物治療藥物的開發和進步。