布魯克的IsoSpark/IsoLight單細胞功能蛋白質組學分析平臺近些年被廣泛應用于細胞療法的臨床前和臨床試驗當中，對回輸前或回輸后的免疫細胞的分泌蛋白組進行評估。并且已經有多篇研究表明免疫細胞的多功能性（分泌兩種或兩種以上細胞因子細胞占比）和PSI（多功能強度指數，多功能細胞和其分泌的細胞因子強度）與患者的預后具有相關性。今天與大家分享近期發表在Nature子刊上面的三篇文章，覆蓋的研究方向包括CAR-T和 CAR-NKT細胞的臨床前細胞效能的影響因素，以及一項臨床I/II期的通用型CAR-NK細胞產品的成果。

01

CAR親和力調節CAR-T細胞

對PD-1/PD-L1介導抑制的敏感性

發表期刊

Nature Communications

文章題目

CAR affinity modulates the sensitivity of CAR-T cells to PD-1/PD-L1-mediated inhibition

通訊作者單位

西班牙IDIBAPS研究所

研究主要內容

針對實體瘤的CAR-T細胞療法面臨著重重阻礙，其中包括由PD-1/PD-L1軸介導的T細胞抑制。研究者已經在探索不同破壞PD-1/PD-L1軸對T細胞的影響。在這項工作中，研究者假設CAR-抗原親和力可能是調節T細胞對PD-1/PD-L1軸敏感性的關鍵因素。他們在各種臨床前模型中系統地研究了以低親和力（LA）或高親和力（HA）靶向HER2的CAR-T細胞。通過使用腫瘤細胞系的體外模型和經過修改以顯示不同PD-L1密度的支持脂質雙層，研究人員發現LA CAR-T細胞對PD-L1介導的抑制的敏感性比HA細胞增加。PD-1敲除可增強LA CAR-T細胞的細胞因子分泌和體外多功能性以及體內抗腫瘤作用，并導致與T細胞衰竭相關的基因特征下調。相比之下，HA CAR-T細胞特征在PD-1敲除后不受影響。這項研究結果可能為涉及破壞PD-1/PD-L1通路的CAR-T療法提供信息，幫助更加有效地治療實體瘤。

單細胞分泌蛋白組分析證明PD-1敲除可增強低親和力而非高親和力CAR-T細胞的多功能性

研究者在bulk RNA測序分析中發現涉及編碼細胞因子的基因的轉錄本變化，并且由于CAR-T細胞的多功能性之前已證明與臨床結果的改善相關，因此他們了評估PD-1敲除是否會增加HER2-28Z CAR-T細胞在抗原暴露后的多功能性。研究者使用布魯克的IsoCode適應性免疫細胞因子芯片對抗原暴露后的低親和力（LA）和高親和力（HA）HER2-28Z CAR-T細胞進行了單細胞分泌組分析。

在3D t-SNE分析中觀察到Mock組和PD-1敲除的LA CAR-T細胞分離成不同的簇，揭示了兩組之間的關鍵功能差異（圖1a）。相比之下，PD-1的敲除對于HA CAR-T的影響并不明顯（圖1b）。這些結果與之前的基因表達分析一致。更深入的分析中，LA HER2-28Z CAR-T細胞中PD-1敲除顯示出在CD4+和CD8+ T細胞群中多功能細胞（能夠分泌兩種或兩種以上細胞因子）增加的趨勢（圖1c），且由于LA HER2 CAR-T細胞中的PD-1破壞，其總體的PSI（多功能強度指數）增加，在分析的32種細胞因子中效應細胞因子占主導地位（圖1e）。相反，在HA HER2-28Z CAR-T細胞中敲除PD-1并沒有顯著增加T細胞的多功能性或PSI，這意味著PD-1破壞的影響較?。▓D1d、f）。單細胞分泌組分析還表明，LA PD-1 KO CAR-T細胞中IL-13、IL-22或IL-4等調節性細胞因子的表達降低，而PD- L1敲除并沒有改變HA CAR-T細胞中這些細胞因子的表達（補充圖）。以上結果表明，與T細胞活化相關的基因上調以及增強的多功能性可能有助于提高 LA HER2-28Z PD-1 KO的抗腫瘤功效。

圖1. PD-1 KO LA 和 HA HER2-28Z CAR-T細胞的多功能性分析。

02

IL-12將表達CAR的自然殺傷T細胞重編程

為具有強效抗腫瘤活性的長壽Th1極化細胞

發表期刊

Nature Communications

文章題目

IL-12 reprograms CAR-expressing natural killer T cells to long-lived Th1-polarized cells with potent antitumor activity

通訊作者單位

美國北卡羅來納大學Lineberger綜合癌癥中心

研究主要內容

人類自然殺傷T細胞（NKT）被越來越多地用于癌癥免疫治療。這項研究發現，表達促炎細胞因子白細胞介素-12（IL-12）能夠使人NKT經歷廣泛且持續的分子和功能重編程。具體來說，IL-12在體內指導并維持NKT中的Th1極化程序，而不會導致其功能衰竭。此外，IL-12在體內能夠維持長期表達CD62L的記憶NKT。值得注意的是，IL-12啟動CD62L陰性NKT中記憶NKT的從頭編程，表明外周血中循環的NKT具有內在的分化層次，并且IL-12能夠促進NKT分化為長壽命的Th1極化記憶細胞。經設計以共表達嵌合抗原受體（CAR）并結合IL-12表達的人類NKT在白血病和神經母細胞瘤腫瘤模型中抗腫瘤活性增強，在體內能長期持續并保留由IL-12表達驅動的分子特征。IL-12揭示出人外周NKT的內在可塑性，這可能在細胞療法的發展中發揮關鍵作用。

單細胞分泌蛋白組分析表達

IL-12的NKT細胞的功能變化

研究者首先構建了表達IL-12的NKT細胞。他們從外周血中分離、擴增和轉導人類NKT。將GFP與IL-12的兩個亞基進行融合表達。NKT的轉導效率和純度分別高于70%和90%。IL-12可在L12(I)GFP NKT上清液中檢測到。與對照GFP NKT相比，IL12(I)GFP NKT表現出更高的IFN-γ釋放和降低的IL-4釋放。相應的qPCR分析也檢測到L12(I)GFP NKT中 IFN-γ和T-bet的mRNA升高。

研究者進一步評估了IL-12表達是否促進多功能NKT的產生。NKT用逆轉錄病毒載體轉導，其中GFP被ΔNGFR交換以允許對轉導的NKT進行分選和處理，以在單細胞分辨率下評估多功能性。表達IL12的活化NKT顯示出明顯更高的多功能性（分泌兩種或更多種細胞因子的細胞百分比）（圖2j和圖3D）。此外，與對照NKT相比，表達IL-12的NKT顯示出更高的多功能強度指數（PSI，多功能性與細胞因子分泌強度的組合)，并且顯示出明顯更高的效應子和炎癥PSI (圖3E)?？傮w而言，這些數據表明表達IL-12的NKT是多功能Th1極化細胞，并且IL-12具有自分泌/旁分泌作用模式。

圖2. 表達IL-12對NKT功能的影響。

圖3.表達IL-12對NKT多功能性和PSI的影響

03

同種異體CD19特異性CAR-NK細胞

在CD19+ B細胞腫瘤中的安全性、有效性

及響應決定因素的一項臨床1/2期試驗

發表期刊

Nature Medicine

文章題目

Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial

通訊作者單位

美國MD安德森癌癥中心干細胞移植和細胞治療系

研究主要內容

該研究是針對37名復發或難治性CD19陽性B細胞惡性腫瘤患者開展一項I/II期試驗，試驗對象是同種異體臍帶血來源的表達抗CD19嵌合抗原受體和白細胞介素15的自然殺傷細胞（CAR19/IL-15 NK）。結果顯示，患者沒有出現嚴重細胞因子釋放綜合征、神經毒性或移植物抗宿主病。第30天和第100天的OR率均為48.6%。一年總生存率和無進展生存率分別為68%和32%，獲得OR的患者有更高水平的CAR-NK細胞數量和更長的持久性。還發現臍帶血單位（CBU）接收時有核紅細胞≤8×107且采集到凍存時間≤24小時是CAR-NK獲得優異結果的最重要預測因素。來自最佳CBU的NK細胞具有高度功能性且高表達效應相關基因。而來自次優CBU的NK細胞會上調炎癥、缺氧和細胞應激程序。這些發現揭示了CAR-NK細胞生物學的新特點，并強調了供體選擇對于同種異體細胞療法的重要性。

單細胞分泌蛋白組分析Opt-Cs和Sub-Cs

中NK細胞的功能

為了確定基于臍帶血單位質量的治療效果差異的潛在機制，分別比較了從最佳（Opt-Cs）和次優（Sub-Cs）CBU得到的CAR-NK細胞。研究者首先比較了輸注產品中CAR的表達、體外增殖和表型，這些參數在Opt-Cs和Sub-Cs的NK細胞之間沒有顯著差異。體外長期腫瘤再攻擊試驗表明，雖然Opt-Cs和Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK細胞在單次腫瘤攻擊后消除CD19陽性Raji細胞的效果相同，但Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK細胞在再攻擊后失去了控制腫瘤生長的能力。多功能性和代謝適應性是有效抗腫瘤NK細胞反應的重要決定因素。IsoCode單細胞分泌蛋白組芯片檢測結果表明，與Sub-Cs相比，來自Opt-Cs的CAR19/IL-15 NK細胞對CD19抗原刺激的多功能強度指數（PSI）明顯更高（圖4b）。線粒體代謝和糖酵解活性分析顯示，來自Opt-Cs的CAR19/IL-15 NK細胞的氧化磷酸化更高(圖4c )，而其糖酵解能力沒有差異 (圖4d )，這表明線粒體適應性更高。為了驗證在臨床CAR19/IL-15 NK細胞產品中觀察到的結果，研究者從臍帶庫中選擇了12個額外的CBU來生成CAR-NK 細胞。研究者還證實了Opt-C對CAR-NK細胞和NT-NK細胞均具有優異的PSI和線粒體適應性。

圖4.臨床CAR19/IL-15 CBU-NK細胞在Opt-Cs和Sub-Cs中的功能差異