蛋白磷酸化/去磷酸化是一種非常重要且廣泛的細胞調節(jié)機制，許多酶、受體蛋白都是通過激酶/磷酸酶的磷酸化/去磷酸化來調節(jié)其功能的激活或抑制。特別是蛋白激酶負責大量細胞轉導信號，并與腫瘤、自身免疫病、炎癥性疾病、退行性神經(jīng)疾病等有著密切關聯(lián)。因此蛋白激酶和蛋白磷酸酶也是非常重要的熱門藥物靶點，且對應的新型藥物形式也不斷被開發(fā)。

蛋白激酶(Protein Kinases)和蛋白磷酸酶 (Phosphatases) 的區(qū)別

蛋白激酶是將ATP末端的磷酸基團(PO4)轉移到含有羥基的底物蛋白氨基酸殘基上，從而實現(xiàn)磷酸化過程。蛋白磷酸化是最常見且最重要的翻譯后修飾（PTMs）之一，在真核生物中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化位點，特別是絲蘇氨酸的占比非常大，酪氨酸磷酸化相對較少。通常依據(jù)激酶對于底物氨基酸的選擇性，可將蛋白激酶分為絲/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶。

而磷酸酶與蛋白激酶功能相反，它是通過將磷酸單酯水解成一個磷酸基團和一個帶有游離羥基的分子來去除磷酸化的蛋白質上的磷酸基團。去磷酸化作用同樣主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。

蛋白激酶 (Protein Kinases)藥物研發(fā)策略

至今，全球已獲批的蛋白激酶抑制劑藥物靶點約占已知人類激酶組類型的20%，因此新型激酶藥物的開發(fā)仍有巨大空間。

基于生化水平的激酶抑制劑高通量篩選

使用HTRF/LANCE（均相時間分辨熒光）技術可實現(xiàn)激酶抑制劑的高通量篩選。（圖2所示），該方法將銪標記于識別底物磷酸化的抗體上，作為 “供體" 熒光分子。而在多肽底物上標記 “受體" 熒光分子，當多肽底物被磷酸化時，就能夠被抗體識別，從而產(chǎn)生FRET信號。

如下（圖3）中MELK激酶活性的檢測實驗，在優(yōu)化好反應條件之后，即可利用該檢測方法篩選激酶抑制劑，測出星形孢菌素對MELK的IC50為9.8nM左右。

基于細胞水平的激酶抑制劑高通量篩選

細胞激酶信號轉導通路參與調控許多重要的細胞過程，如細胞存活、分化和凋亡。激酶信號網(wǎng)絡的典型特征是多個激酶排列在級聯(lián)中。HTRF/ALPHA技術已經(jīng)開發(fā)用于研究激酶信號通路，以及篩選化合物文庫以尋找修飾受體或激酶活性。如（圖4）所示，使用ALPHA技術在A375細胞上測試兩款激酶抑制劑 (MEK抑制劑：U0126和PD 98059) ，檢測其對pERK和pAKT的產(chǎn)生的抑制能力，分別測得U0126 的IC50為28.7 nM，PD 98058的IC50為0.66 μM。

蛋白磷酸酶 (Phosphatases)的研發(fā)策略

LANCE技術可以檢測絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸酶的活性。使用ULight標記的磷酸化肽作為酶底物，通過檢測肽的去磷酸化的信號來表征磷酸酶反應活性，磷酸酶抑制劑會部分或全部恢復原來的TR-FRET信號。（圖5）使用磷酸化的ULight標記肽4E-BP1 (pThr46) 對PP1A和PP2A磷酸酶進行檢測。結果表明信號減少的模式與使用32P放射性標記肽一致，并且LANCE用到的酶量更少，LANCE技術非常適合于開發(fā)穩(wěn)健和敏感的信號減少磷酸酶測定，并用于表征抑制劑的效果。

HTRF激酶活性檢測試劑盒

胞內蛋白檢測試劑盒

參考文獻

[1] Ardito F, Giuliani M, Perrone D, Troiano G and Lo Muzio L: The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy (Review). Int J Mol Med 40: 271-280, 2017