背景

靶向治療癌癥一直是科研界研究抗癌的一個關鍵領域。ERK與MYD88之間的相互作用已被證明對于RAS依賴的細胞轉化和癌細胞存活至關重要。因此，抑制ERK-MYD88相互作用可能成為一種有效的癌癥治療策略。然而，現有的ERK激酶抑制劑往往會導致癌細胞的適應性反應和耐藥性，這就需要探索新的治療策略。

法國里昂癌癥研究中心Toufic Renno、Isabelle Coste團隊在Nature Communications雜志發表了題為“Targeting ERK-MYD88 interaction leads to ERK dysregulation and immunogenic cancer cell death"的研究論文。在這項研究中，研究人員利用瑞孚迪（Revvity） HTRF PPI（蛋白-蛋白互作）試劑從66000個小分子中發現一種苯并咪唑類化合物EI-52能通過破壞ERK-MYD88相互作用誘導癌細胞特異性免疫原性細胞凋亡，從而殺死腫瘤細胞并激活抗腫瘤T細胞反應發揮抗腫瘤作用。并且利用瑞孚迪Quantum GX2 microCT評價了其在活體動物水平對于腫瘤細胞治療效果。

結果

1瑞孚迪HTRF PPI試劑助力ERK-MYD88相互作用抑制小分子EI-52的鑒定和表征

研究人員首先通過瑞孚迪均相時間分辨熒光 (HTRF) PPI（蛋白-蛋白互作）試劑分析篩選了約66,000個小分子，尋找能夠破壞MYD88蛋白D結構域與ERK蛋白的D募集位點之間相互作用的分子,其篩選儀器采用瑞孚迪多功能酶標儀EnVision。初步篩選出75種化合物，并根據理化性質和構效關系進行，最終選擇了苯并咪唑和螺環兩類具有相似活性的化合物進行進一步開發。苯并咪唑化合物EI-52（圖1A）通過熒光猝滅（圖1B）和HTRF實驗（圖1C）顯示其與ERK1和ERK2結合，并抑制ERK與MYD88的相互作用。為確定EI-52在ERK上的結合位點，研究人員使用P2Rank預測引擎，識別出一個可能的結合槽 (Zone A) (圖1D) ，其包含多個重要的芳香族和帶負電的殘基。進一步計算模型顯示，EI-52的二甲氨基苯基基團可能與Zone A的天冬氨酸和谷氨酸殘基（ERK2中的D316、D319、E79）相互作用，SP-26作為對照化合物也顯示了類似的結合模式。研究人員在細胞實驗中通過雙分子熒光互補 (BiFC) 測定（圖1E）和鄰位連接測定 (PLA) (圖1F) 驗證了EI-52抑制ERK-MYD88相互作用，并確認ERK上的319位天冬氨酸對該結合至關重要（圖1G）。研究結果表明，EI-52可以直接與ERK蛋白的D募集位點結合并有效抑制ERK-MYD88的相互作用。

圖1：EI-52抑制ERK-MYD88蛋白-蛋白相互作用并誘導癌細胞死亡[1]

2小分子EI-52抑制劑可誘導癌細胞死亡

先前研究表明ERK-MYD88相互作用對癌癥的持續存在至關重要，因此研究人員探討了EI-52對癌細胞存活的影響。將人結腸癌細胞HCT116 (K-RasG13D) 暴露于8 μM的EI-52或相同濃度的ERK激酶抑制劑，48小時后，EI-52顯著誘導了癌細胞死亡（圖1H），而ERK激酶抑制劑處理后無明顯細胞死亡。螺環化合物SP-26同樣誘導了HCT116細胞死亡。流式細胞術顯示，HCT116細胞經EI-52處理24小時后，磷脂酰絲氨酸暴露，表明細胞死亡為凋亡性（圖1I）。研究人員進一步評估了幾十種EI-52類似物對ERK-MYD88相互作用的抑制能力及誘導癌細胞死亡的效果。構效關系 (SAR) 研究表明，一些類似物功能上與EI-52相似，而另一些則無效，這排除了EI-52生物活性是由苯并咪唑骨架非特異性效應引起的可能性，并為后續藥物優化提供了基礎。研究人員還擴展了分析，測試了Oncopanel™集合中的301個細胞系對EI-52的反應。結果顯示，80%的細胞系對EI-52表現出中等敏感性（IC50為3.4到11 µM），10%表現出高敏感性（IC50低于3.4 µM），另10%表現出低或無敏感性（IC50高于11 µM）（圖2A）。不同腫瘤類型對EI-52的反應存在異質性（圖2B）。與其他63種抗腫瘤參考化合物相比，EI-52的敏感性模式，表明其具有作用機制（圖2C）。

圖2：EI-52的活性在機理上是且與腫瘤類型無關[1]

3瑞孚迪Quantum FX microCT助力E1-52在活體小鼠抗腫瘤活性評價

為了研究EI-52在體內的抗腫瘤活性，研究人員在同系Lewis肺癌 (LLC) 模型中進行了測試。體外實驗確認，EI-52以IC50 = 4 μM的濃度誘導LLC細胞凋亡。腹腔內 (i.p.) 給藥的藥代動力學研究顯示，EI-52的生物利用度為52.9%，AUC為1129 ng/ml/h，適合用于概念驗證研究。在LLC小鼠模型中，EI-52通過i.p.給藥表現出劑量依賴性抑制腫瘤生長的效果（圖3A）。在Kras-LA2自發性肺腫瘤模型中，通過瑞孚迪Quantum GX2 microCT掃描EI-52治療10周后顯著減少了肺部腫瘤負荷（圖3B），且未見肝臟、腎臟或脾臟的毒性跡象。此外，EI-52在雞胚胎絨毛尿囊膜 (CAM) 模型中未顯示出急性毒性，進一步支持了其在體內的安全性。研究人員還研究了EI-52在離體人類腫瘤中的抗癌效果。患者來源的結腸和肺腫瘤類器官在EI-52處理48小時后顯示出凋亡跡象（圖3C）。在頭頸癌切片的離體模型中，EI-52處理導致腫瘤細胞中強c-PARP染色，顯示其腫瘤特異性（圖3D）。綜上所述，EI-52通過抑制ERK-MYD88蛋白相互作用，能夠有效誘導人類癌細胞的凋亡，而無明顯毒性。

圖3：使用EI-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用觸發免疫原性癌細胞死亡和抗腫瘤T細胞反應[1]

4E1-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用誘導癌細胞死亡和抗腫瘤T細胞反應

為了解EI-52對整體轉錄活性的影響，研究人員使用Affymetrix芯片分析了HCT116細胞在EI-52處理16小時后的基因表達情況，發現NF-κB依賴的炎癥基因表達上調（圖4A），包括趨化因子（圖4B），這些基因的表達在RNA（圖4C）和蛋白質水平上得到了證實（圖4D）。與MEK激酶抑制劑U0126不同，EI-52處理激活了NF-κB、CXCL1和CXCL8的轉錄（圖4E）。p65敲低實驗顯示NF-κB在IL-8分泌中的關鍵作用（圖4F）。同時，EI-52處理后p65和ERK在HEK293T細胞中發生免疫共沉淀（圖4G），表明ERK蛋白復合體發生變化，可能帶來不同的生物學效應。瀕死癌細胞產生趨化因子被認為是免疫原性細胞死亡 (ICD) 程序的一個指標。EI-52誘導的細胞死亡伴隨著ATP和HMGB1的釋放（圖4H），這些分子具有趨化活性，能夠吸引THP1巨噬細胞（圖4I）。而U0126未引起ICD介質的產生或HCT116細胞對巨噬細胞的趨化作用（圖4H，I）。這些結果突顯了ERK激酶活性抑制與ERK-MYD88蛋白相互作用抑制之間的功能差異。在體內研究中，腹腔注射EI-52 24小時后，腫瘤中檢測到240-440 ng/g的藥物濃度，腫瘤細胞表現出顯著的PARP裂解（圖5A，B），表明系統性給藥EI-52可有效暴露腫瘤并迅速引發癌細胞的凋亡。研究人員還探討了T細胞對EI-52抗腫瘤活性的可能貢獻。結果顯示，EI-52處理僅在裸鼠中略微減緩腫瘤生長，在T細胞功能正常的小鼠中，EI-52表現出更強的抗腫瘤效果，表明其能誘導免疫反應（圖5C）。此外，EI-52與抗PD1抗體聯合使用，顯著提高了抗腫瘤療效（圖5D）。

圖4：EI-52在體外誘導免疫原性癌細胞死亡[1]

圖5：EI-52抑制ERK-MYD88相互作用在體內誘導癌細胞死亡和免疫T細胞反應[1]

總結

在這篇報告中，研究人員介紹了兩類化合物（螺環和苯并咪唑類），它們通過作用于ERK蛋白的D募集位點區域，破壞ERK與MYD88的相互作用并擾亂ERK復合物，從而在體內引發早期免疫原性凋亡和抗腫瘤T細胞反應。雖然ERK-MYD88蛋白相互作用抑制劑EI-52對癌細胞的具體分子效應仍需進一步研究，但ERK伴侶蛋白的非典型調控、細胞死亡動力學及細胞系敏感性譜均指向一種作用機制。研究人員的研究表明，EI-52會導致活化的ERK錯誤定位，并伴隨綜合應激反應，引起細胞凋亡。

這些研究結果表明，通過抑制ERK-MYD88相互作用可能是一種有前景的癌癥治療方法。尋找靶向該相互作用的療法有望成為抗擊癌癥的關鍵。

在這項研究中，瑞孚迪公司的先進技術和儀器發揮了至關重要的作用。

瑞孚迪整體藥物研究解決方案

采用HTRF PPI試劑搭配EnVision多功能酶標儀進行高通量化合物篩選、靶點功能驗證，從66000化合物中成功找到能阻斷ERK-MYD88結合小分子E1-52。

采用EnVision多功能酶標儀超敏化學發光進行了細胞增殖實驗的檢測。

利用Quantum GX2 microCT進行E1-52動物活體水平肺部腫瘤治療評價。

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關于Quantum GX2 microCT

Quantum GX2活體microCT系統能夠在不處死動物的情況下對每一只動物模型進行多個時間點的連續觀察而不用擔心輻射劑量問題。Quantum GX2使用快速成像的CMOS平板檢測器，能夠縮短成像時間，同時利用回顧性的呼吸門控可以避免肺部呼吸造成的運動偽影，是在活體水平對肺相關疾病進行評價的利器。