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賽爾瑞成（北京）生命科學技術有限公司
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一、細胞培養前期準備工作
細胞培養儀器設備：
◆ 細胞培養通風櫥（即生物安全柜）
◆ 培養箱（通用推薦：濕式二氧化碳培養箱）
◆ 離心機
◆ 醫用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低溫冰箱（-80℃）、液氮冷凍罐
◆ 倒置顯微鏡
其他用品：細胞培養容器（培養瓶、培養皿、多孔板等），吸管和移液器，培養基、血清和試劑
注意事項：
◆ 無菌工作區域：細胞培養實驗室的主要要求是需要維持細胞培養操作工作區域處于無菌狀態，簡單經濟的方式就是使用細胞培養通風櫥。
◆ 無菌試劑和培養基：商品化試劑和培養基經過嚴格的質量控制以確保無菌，注意操作過程中不要被污染，其他試劑和溶液需要選擇適當的滅菌方法（例如：高壓蒸汽、無菌過濾等）進行滅菌。
◆ 無菌操作：要求操作人員在實驗開始前對工作區域和雙手操作部分進行75%酒精消毒；盡量使用一次性塑料吸管進行單次操作，避免交叉污染；試劑瓶和培養用具使用時方可開蓋，用后要盡快蓋上，暴露于環境中的時間盡可能要短。
◆ 整體的細胞實驗環境也彌足重要，需要定期對實驗室環境進行較為*的清掃消毒和殺菌，包括實驗用儀器和室內地面、桌面等。
二、細胞的復蘇與凍存
細胞復蘇：
1. 在細胞狀態不足以滿足實驗需求或者出現細胞污染的情況下，需要進行細胞復蘇：
2. 從超低溫冰箱或者液氮中取出自保存或商品化購買的凍存細胞后，快速轉移至37℃水浴條件下輕輕轉動融化（一分鐘內）。
3. 75%酒精擦拭凍存管外部后，轉移至通風櫥中。
4. 加入適量新鮮的*培養基混合，約800-1000rpm下離心5-10分鐘，實際離心速度時間取決于細胞種類和細胞狀態。
5. 新鮮培養基重懸后接種于相應的培養器皿中，做好標記，37℃，5%CO2條件下培養。
細胞凍存：
1. 為現有細胞系做細胞儲備，需要對代數相對靠前的細胞進行擴增培養和細胞凍存：
2. 準備細胞凍存液，置于2℃-8℃下備用。
觀察待凍存的細胞，密度達到80%-90%左右，將貼壁/懸浮細胞分別按照傳代方法收集。
3. 使用血球計數板對細胞密度進行大致估算后，計算出凍存溶液的體積，從而保證單支凍存細胞有足夠的細胞量用于復蘇。
4. 約800-1000rpm下離心5-10分鐘，無菌條件下小心棄去培養基，不要攪動細胞沉淀。
5. 用合適體積的預冷后凍存液重新混懸細胞沉淀，分裝至凍存管中，做好標記后進行梯度降溫至液氮環境中保存，入庫。
★★★對于傳統的細胞凍存，需要進行程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮）凍存，為避免操作流程的繁瑣不可控，可選用本公司自主研發的無血清非程序降溫細胞凍存液，包括Cellregen無血清細胞凍存液和無血清低DMSO細胞凍存液。兩種細胞凍存液均有無血清、無動物源蛋白、非程序降溫的特點，可直接放置-80℃冰箱凍存。Cellregen無血清細胞凍存液已經得到了市場廣泛認可，用戶遍布全國科研院所、大學、醫院和企業。無血清低DMSO細胞凍存液是公司新開發的更加低毒、高效的凍存液產品，為客戶提供更多選擇。
附：凍存液對比表
| 通用細胞凍存液 | Cellregen 無血清細胞凍存液 | 無血清低 DMSO 細胞凍存液 |
主要成份 | 含血清、含 DMSO | 不含血清，含 DMSO 10% | 不含血清，低 DMSO 5% |
細胞毒性 | 高 | 高 | 低 |
安全性 | 低 動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風險偏高 | 高 無動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風險 | 高 無動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風險 |
凍存細胞種類 | 適合含血清細胞凍存 | 通用型 適合各類細胞凍存 | 通用型 適合各類細胞凍存 |
無血清培養細胞生長狀態 | 易改變易由懸浮狀態回復貼壁狀態 | 保持懸浮培養狀態 | 保持懸浮培養狀態 |
批次差異 | 批次差異大 | 無批次差異 | 無批次差異 |
操作方法 | 步驟繁瑣 需程序降溫凍存 | 簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 | 簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
保存設備 | 要求高（液氮） | 要求低（ -80℃ 冰箱） | 要求低（ -80℃ 冰箱） |
微量凍存 | 細胞易死亡，存活率偏低 | 細胞存活率高 | 細胞存活率高 |
原位凍存 | 不可行 | 可行，且方便快捷 如 : 雜交瘤細胞孔板凍存 | 可行，且方便快捷 如 : 雜交瘤細胞孔板凍存 |
注意事項：
◆ 細胞的復蘇中，如細胞對溫度比較敏感，可將生長培養基預熱至37℃后再加入融化后的細胞凍存液中混勻。
◆ 將復蘇的細胞高密度接種，如兩支凍存細胞接種到一個孔板中，可有效提高復蘇效率。
◆ 細胞凍存，在加入凍存液進行分裝的過程中，要不時輕輕混合細胞，使其保持均勻的細胞懸液狀態，更有利于保證細胞的凍存效果。
三、細胞傳代
貼壁細胞傳代流程：
1. 當培養貼壁細胞密度達到80%左右即可細胞的傳代操作，從培養器皿中吸棄原有的細胞生長培養基。
2. 使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液輕輕潤洗細胞（緩沖液用量根據培養器皿的表面積調整），避免攪動細胞，前后輕晃動器皿數次。
3. 吸棄緩沖液，重復潤洗一次。
4. 向培養器皿中加入適量的預熱解離劑（如胰蛋白酶等），充分覆蓋細胞層，輕輕晃動容器數次。
5. 將培養器皿在室溫下孵育2-5分鐘。實際孵育時間實際根據細胞系的種類不同而定。6. 移至倒置顯微鏡下觀察細胞解離情況，可輕輕拍打器皿壁沿以加快細胞解離。
7. 當細胞解離程度大于90%，加入三倍于解離液體積的生長培養基中止解離過程，輕輕晃動后吹打細胞，收集至無菌離心管中。
8. 約800-1000rpm下離心5-10min，實際離心速度時間取決于細胞種類和細胞狀態。
9. 棄去含解離劑的上清溶液，用少體積的生長培養基重懸細胞沉淀，混勻后取出少量使用血球計數板計算細胞數量。
10. 將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉移至新的細胞培養器皿中放回培養箱。
懸浮細胞傳代流程：
1. 當細胞生長至適合傳代（即處于對數生長期而未達到聚合的狀態）時，從培養瓶中吸取出少量的細胞樣品，如有細胞已部分沉淀，要先輕輕晃動培養瓶使細胞處于均勻的懸浮狀態后再取樣。
2. 使用血球計數板對細胞進行計數。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度所需要的加入的培養基體積，如有必要，可先對培養瓶中細胞進行離心收集（800-1000rpm、5-10min）后再重懸計數和接種。
4. 在無菌狀態下將適量預熱的生長培養基加入培養瓶中，必要時可將培養的細胞分散接種到多個培養瓶中。
5. 將培養瓶的旋蓋外旋一圈，便于進行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養瓶放回培養箱中繼續培養。
注意事項：
◆ 貼壁細胞在進行解離（消化）過程中，如果室溫下效果不理想，可轉移至37℃培養箱中加快該過程，但要注意控制時間，每30秒需要鏡檢一次。
◆ 細胞在緩沖液潤洗過程中要盡量**，培養液中的血清殘留會影響消化效果。
◆ 為了減少細胞碎片和無用的代謝副產物在培養液中累積，每三周或者必要時都應將懸浮細胞收集起來進行一次離心重懸再接種，具體操作等同于正常的傳代培養。
◆ 通常情況下，懸浮細胞培養中所需添加特定的生長依賴因子，盡量按照“現用現添加”的原則，從而保證培養基中該物質的濃度足夠滿足細胞的生長需求。
