光度定義
分光光度法是在定波長處或定波長范圍內光的吸收度，對該物質行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區，(2)380~780nm的可見光區，(3)2.5~25μm(按波數計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的度和準確度，所有儀器應按照家計量檢定規程或本附錄規定，定期行校正檢定。、
儀器組成
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。
光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200~400 nm的紫外光區.不同的光源都有其有的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。
鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400~760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。
分光光度計圖片
分光光度計圖片
氫燈(或氘燈)的發射光譜:氫燈能發出185~400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。
原理
分光光度計采用個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生定波長的光源，光線透過測試的樣品后，分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強度;
I 為透射的單色光強度;
T 為物質的透射率;
k 為摩爾吸收系數;
L 為被分析物質的光程，即比色皿的邊長;
c 為物質的濃度;
物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收但可在定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或對照品同時操作。
