逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）實(shí)驗(yàn)作為是常見(jiàn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之一，逆轉(zhuǎn)錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程，即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板。雖然看上去步驟簡(jiǎn)單，但是逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中實(shí)際操作時(shí)常出現(xiàn)問(wèn)題如下：

1. 如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性？

① 確定模板 RNA 完整性好，無(wú) DNA 污染。

② RNA 模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑。

③ 使用適量的模板 RNA ，模板量太多會(huì)降低特異性，太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱。

④ 若模板中有二級(jí)結(jié)構(gòu)，可通過(guò)提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來(lái)提高擴(kuò)增效果。

 

2.  RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí)，怎么處理？

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等。可將已確定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合，同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測(cè) RNA 抑制劑；若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說(shuō)明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對(duì) RNA 沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。

 

3. 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。

① RNA 模板質(zhì)量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

② 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用，所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其*佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）。

③ 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因（復(fù)雜和長(zhǎng)度），可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因的引物，避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)。或者用三步法程序或延長(zhǎng)兩步法程序的延伸時(shí)間。

⑤ 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差，可以通過(guò)做平行不用品牌產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。

 

4. 逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增效率評(píng)估，應(yīng)該關(guān)注哪些指標(biāo)？

建議： qPCR-ct 值，或者 PCR 產(chǎn)量

如果想比較逆轉(zhuǎn)錄性能，尤為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，這種方法相對(duì)較為準(zhǔn)確。

不建議：cDNA 中間產(chǎn)物濃度測(cè)定 or 其他方法。

逆轉(zhuǎn)錄完成后是不建議測(cè)定產(chǎn)物濃度的，由于逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈，溶液中的 RNA 和部分 DNA 會(huì)對(duì)吸光值產(chǎn)生影響，所以測(cè)定出來(lái)的產(chǎn)物濃度并不準(zhǔn)確，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，由于不同品牌之間的逆轉(zhuǎn)錄體系具有或多或少的差異，其體系中的各種離子等都能對(duì)吸光度產(chǎn)生影響，所以測(cè)定的結(jié)果也沒(méi)有可比性。

 

優(yōu)化及注意事項(xiàng)：

1、 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 時(shí)，提取 RNA 是關(guān)鍵，需分離高質(zhì)量 RNA（純度和完整性）。

2、 整個(gè)操作過(guò)程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。

3、 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中要謹(jǐn)防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制劑。

4、 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。

5、 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)應(yīng)全程在冰上操作完成，操作過(guò)程應(yīng)避免 RNase 污染。

6、 提高逆轉(zhuǎn)錄預(yù)熱溫度（也可根據(jù)相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行調(diào)整）。

7 減少基因組 DNA 污染，可使用去基因組的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。