【產品名稱】

商品名稱：豬傳染性胃腸炎/豬流行性腹瀉病毒/豬 A 組輪狀病毒（TGEV/PEDV/PRV-A）核酸檢測試劑盒（三重熒光 PCR 法）

Name： Transmissible Gastroenteritis Virus ， Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Rotavirus Type A Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

豬傳染性胃腸炎（TGEV）、豬流行性腹瀉（PEDV）及豬 A 組輪狀病毒（PRV）感染，是豬場常見的病毒性腹瀉，此三種病毒性腹瀉造成了豬場飼料報酬降低、藥物和人力增加等重大損失，是危害豬場最嚴重的   疾病之一。三者均為高度接觸性腸道疾病，具有相似的臨床表現及傳染途徑，其鑒別診斷通常需要借助實驗   室診斷技術。PCR      技術具有特異性強，敏感度高，可進行活體診斷等特點，在實驗室診斷中具有較突出的優勢。本試劑盒適用于檢測標本中的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒和豬 A 組輪狀病毒，適用于豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒、豬 A 組輪狀病毒感染的輔助診斷及流行病學調查。

【檢驗原理】

本試劑盒用豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒、豬 A 組輪狀病毒的特異性引物和探針，用一步法熒光RT-PCR 技術對豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

TGEV/PEDV/PRV-A 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

TGEV/PEDV/PRV-A 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5，有效期 9 個月。

【適用儀器】

ABI 7300 、7500 、ABI Stepone/Stepone Plus 、安捷倫 MX3000P/3005P 、Roche Gene 6000 、Roche LC480 、 

Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

剖檢豬取腸內容物和腸系膜淋巴結；待檢活豬，取排泄物，于離心管中。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

組織：分別從腸系膜淋巴結的 3 個不同位置取樣，稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻，再稱取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；排泄物：取 0.5g 于 1.5mL 滅菌離心管中，加入 1mL 生理鹽水渦旋振蕩， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按    照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑TGEV/PEDV/PRV-A 反應液酶液

用量20μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM、TEXAS RED、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11cycle42℃20min否

21 cycle95℃10min否

340 cycle94℃15sec否

55℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內調節）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內調節），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2結果判斷

FAM 通道為豬流行性腹瀉病毒檢測結果，CY5 通道為豬傳染性胃腸炎病毒檢測結果，TEXAS RED 通道為豬 A 組輪狀病毒檢測結果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質控標準

陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。