用于 MS 分析的尿蛋白的制備和 HILIC SPE 凈化

該方案描述了使用 MagReSyn® HILIC 進(jìn)行自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)的尿液樣品的高效樣品制備和凈化。

材料：所有試劑和化學(xué)品應(yīng)為分析級(jí)或更高級(jí)別，最好是 MS 級(jí)。

Reagent or Equipment                                                                   Description and catalogue number

MagReSyn® HILIC                                                                          MR-HLC002

Ammonium acetate (NH4Ac)                                                         Fluka A1542-500g

Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)                                            Fluka 40867-50g

Dithiothreitol (DTT)                                                                       VWR 0281-25G

Iodoacetamide (IAA)                                                                     MERCK I1149-25G

Protein LoBind tubes                                                                    Eppendorf 0030108450

Magnetic bead handling station for automated protoco            KingFisher Duo or Flex

Magnetic separator for manual protocol                                    DynaMag™-2 Magnet Catalog number: 12321D

MS grade water                                                                           Pierce™ 51140

Peptide quantification method                                                   Pierce™ Colorimetric (23275) or Fluorometric (23290) Peptide Assay

Adjustable Pipettes

Sodium dodecyl sµlphate (SDS)                                                 MERCK L4509-1Kg

Urea                                                                                            MERCK U5378-1Kg

注意：上面建議的化學(xué)品已經(jīng)過(guò)測(cè)試，可用于本協(xié)議，但也可以使用同等等級(jí)的化學(xué)品

試劑制備：

DTT Stock: 1M DTT in LCMS grade H2O (prepare fresh)

• IAA Stock: 1M IAA in LCMS grade H2O (prepare fresh, light sensitive)

• Urea sample buffer: 8M urea, 2% SDS (prepare fresh)

• Equilibration Buffer: 15% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5 (diluted from 1M NH4Ac stock)

• Binding Buffer: 30% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5

• Wash Buffer: 95% Acetonitrile in LCMS grade H2O

• Trypsin Digestion Buffer: 50mM NH4HCO3 LCMS grade H

注：緩沖液可在 4°C 下保存長(zhǎng)達(dá) 2 周。

方法：

注意：

該方法是使用 Kingfisher™ 磁性處理站開發(fā)和基準(zhǔn)測(cè)試的。如果您無(wú)法使用磁性處理站，您可以遵循下面詳述的協(xié)議（手動(dòng)格式）。 • 建議新鮮制備所有緩沖液。 • 應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)采集程序采集尿液樣本。建議收集第一天早上干凈的尿液樣本進(jìn)行臨床分析。樣品應(yīng)保存在冰上，直到通過(guò)離心處理去除碎片（800 x g，10 分鐘）。如果不立即使用，等分試樣必須儲(chǔ)存在 -80 °C。

尿液制備

1. 在冰上解凍尿液樣本

2. 將 100 µl 尿液轉(zhuǎn)移至新的 2ml LoBind® Eppendorf 管中。

3. 添加 300 µl 尿素樣品緩沖液并渦旋混合 10 -15 秒。

4. 使用終濃度為 10 mM DTT 在室溫下還原 30 分鐘。

5. 使用最終濃度為 30 mM IAA 的烷基化蛋白質(zhì)，在室溫下避光 30 分鐘。

6. 通過(guò)添加另外 10 mM DTT 來(lái)淬滅 IAA

微粒平衡：

7. 通過(guò)渦旋混合或翻轉(zhuǎn)重新懸浮 MagReSyn® HILIC，以確保均勻懸浮液。注意：當(dāng)制備多個(gè)樣品時(shí)，請(qǐng)通過(guò)定期混合來(lái)確保保持均勻的懸浮液，例如在轉(zhuǎn)移所需體積之前倒置或上下移液微?；旌衔?。

8. 將 10 µl MagReSyn® HILIC (200 µg) 微粒轉(zhuǎn)移至 2 ml Protein Lo-Bind 管中。

9. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。

10. 用移液管吸出運(yùn)輸溶液并丟棄。

11. 將微粒重懸于 200 µl 平衡緩沖液（參見上文）中，同時(shí)攪拌（例如輕輕渦旋混合）15-30 秒，以洗滌微粒。

12. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。

13. 用移液管吸出平衡溶液并丟棄。

14. 重復(fù)步驟 12 – 14。注意：只有在準(zhǔn)備好添加樣品后，才從微粒中取出第二個(gè)平衡溶液（參見下面的步驟 15）。這將確保微粒不會(huì)風(fēng)干，并且在添加樣品時(shí)可以輕松地重新懸浮。

樣品結(jié)合和清洗：

15. 將（來(lái)自步驟 6）還原和烷基化的樣品與 (416 µl) 結(jié)合緩沖液（30% ACN，100 mM NH4Ac pH 4.5）以 1:1 (v/v) 比例混合。

16. 轉(zhuǎn)移尿素樣品緩沖液 - 將緩沖液混合物與步驟 14 中的平衡微粒結(jié)合。注意：如果自動(dòng)化工作流程，請(qǐng)參閱儀器的體積參數(shù)，以確保凈化的兼容性。

17. 在室溫下孵育 30 分鐘并持續(xù)混合（例如緩慢渦旋）以確保樣品和微粒充分相互作用。

18. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。用移液器抽吸除去并丟棄未結(jié)合的部分。

19. 用 200 µl 洗滌緩沖液洗滌微粒，并輕輕攪拌混合 60 秒。可選：可以將微?；旌衔镛D(zhuǎn)移到新的 2ml Protein Lo-Bind 管中，以確保留在管側(cè)壁上的污染物在后續(xù)消化步驟中不會(huì)重新引入樣品中。

20. 將管放在磁力分離器上，并允許 5 -10 秒清除微粒。除去上清液并丟棄。 21. 重復(fù)步驟 19 和 20 中描述的清洗步驟。

珠上蛋白質(zhì)消化：

22. 通過(guò)添加 200 µl 50 mM 碳酸氫銨 pH 8.0（含有 1 µg 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（酶：蛋白質(zhì)比例 1:30））進(jìn)行珠上消化，并在 47 °C 下孵育 2 小時(shí)。確保充分混合以使顆粒在消化過(guò)程中保持在溶液中。可選：還可以將 0.25 µg 測(cè)序級(jí) LysC 添加到消化緩沖液中以改善消化。

23. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。

24. 取出肽溶液并放入 0.5 ml Eppendorf LoBind 管中?？蛇x：為了提高肽回收率，可以將微粒與 50 至 100 µl 1% TFA 一起孵育 5 分鐘，同時(shí)混合，然后將上清液與步驟 29 中的消化溶液合并。

25. 對(duì)樣品進(jìn)行真空或冷凍干燥并重懸于 20-40 µl LCMS 溶劑中，例如2% ACN 和 0.2% 甲酸

26. 進(jìn)行比色肽測(cè)定以確定肽回收率并調(diào)整 LC-MSMS 分析的負(fù)載。可選：可以使用比色測(cè)定來(lái)評(píng)估 HILIC 方法去除 SDS 的效率，該比色測(cè)定可以測(cè)量肽存在下的 SDS 一致性，例如 Arand、Friedberg 和 Oesch，1992 年中描述的方法。

27. 通過(guò) LC-MSMS 分析消化物。注：如果使用不帶陷阱洗脫選項(xiàng)的納米 LCMS 設(shè)置，建議使用標(biāo)準(zhǔn) C18 脫鹽工作流程進(jìn)一步對(duì)消化液脫鹽

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