目的
本應(yīng)用表明 Sievers*Eclipse 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀(BET，Bacterial Endotoxins Testing)所使用的起效光密度(OD，Optical Density)值與 96 孔微孔板測(cè)試所使用的起效光密度值是等效的。Sievers Eclipse 微孔板的孔的形狀和光路徑長(zhǎng)度不同于 96 孔板的孔的形狀和光路徑長(zhǎng)度，因此需要用比爾定律(Beer’s Law)和吸光度方程來(lái)重新計(jì)算 Sievers Eclipse 微孔板的光密度值。證明上述兩種平臺(tái)的光密度值的等效性非常重要，這是因?yàn)樵趧?dòng)態(tài)顯色分析中，起效光密度值用于確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的起效反應(yīng)時(shí)間。
概述
動(dòng)態(tài)內(nèi)毒素測(cè)試依賴于光密度值和內(nèi)毒素濃度變化之間的反比關(guān)系。光密度是“用分光光度計(jì)測(cè)量的特定波長(zhǎng)的有機(jī)分子懸浮液或溶液所吸收的光量。”1當(dāng)光通過(guò)含有標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)和鱟 試 劑 ( LAL ， LimulusAmoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物)的混合液的光學(xué)孔時(shí)，軟件就會(huì)報(bào)告光密度值的變化。對(duì)于動(dòng)態(tài)分析法來(lái)說(shuō)，起效光密度值是用來(lái)確定起效反應(yīng)時(shí)間的恒定值。內(nèi)毒素濃度高的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速度較快，溶液顏色會(huì)變黃，使到達(dá)光電二極管的光量較少，因而光密度值較高。起效反應(yīng)時(shí)間(即達(dá)到起效光密度所需的時(shí)間)越短，樣品中的內(nèi)毒素含量就越高。
每次測(cè)試完畢后，軟件都會(huì)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示起效反應(yīng)時(shí)間(以對(duì)數(shù)形式)和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度(以對(duì)數(shù)形式)之間的線性關(guān)系。然后將反應(yīng)性樣品和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照液(PPC，Positive Product Controls)的起效反應(yīng)時(shí)間同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，得出內(nèi)毒素的量化結(jié)果。測(cè)得的起效光密度值經(jīng)過(guò)優(yōu)化，都被概括在使用說(shuō)明(IFU，Instructions For Use)中。起效光密度值可以是一個(gè)定值，也可以是一系列值。起效光密度也被稱為“閾值光密度” 或 “反應(yīng)光密度”。
比爾定律
鱟試劑生產(chǎn)商記錄的光密度值是根據(jù)比爾定律和含有混合液的微孔板的測(cè)量厚度(即光路徑長(zhǎng)度)計(jì)算出來(lái)的。比爾定律又 被 稱 “ 朗伯比爾定律( BeerLambert’s Law)”，規(guī)定：“溶液的化合物濃度與溶液的吸光量成正比。”2
朗伯比爾定律
?? = ?????
其中：
A = 吸光度(無(wú)單位)
? = 摩爾吸光系數(shù)(L mol-1cm-1)
b = 光通過(guò)溶液的路徑長(zhǎng)度(cm)
c = 樣品中化合物的濃度(mol L-1)
為了充分理解上面的方程式，請(qǐng)看下面的吸光度方程式。吸光度取決于光強(qiáng)度。測(cè)量參照池或無(wú)溶液的池，得出光強(qiáng)度 Io。然后測(cè)量樣品池或有溶液的池，得出光強(qiáng)度 I。 將這兩個(gè)值代入以下公式，得出吸光度。
吸光度
在考慮吸光度時(shí)，光學(xué)孔的形狀和大小也很重要。光路徑為 1 cm 的立方體形孔中的溶液就比光路徑為100 cm 的管狀孔中的溶液的吸光度低，這是因?yàn)榍罢哂休^少分子與光相互作用。 Sievers Eclipse 微孔板的孔的形狀和路徑長(zhǎng)度不同于 96 孔板的孔的形狀和路徑長(zhǎng)度，因此需要用上述兩個(gè)方程式來(lái)重新計(jì)算起效光密度值。
Sievers Eclipse 的等效光密度不同的生產(chǎn)商或供應(yīng)商所提供的 96 孔板的光路徑長(zhǎng)度略有不同。平底 96 孔板的孔通常是截錐形，使微孔板容易從模具上脫模。我們用幾家主要的微孔板生產(chǎn)商、儀器生產(chǎn)商、LAL 供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù) 96 個(gè)孔中共有 200 µL 溶液來(lái)確定光路徑長(zhǎng)度，得出的數(shù)值范圍是 5.707 mm - 6.306 mm。
為了將上述范圍縮小到一個(gè)定值，位于美國(guó)科羅拉多州博爾德市的蘇伊士水務(wù)技術(shù)與方案分析儀器公司(SUEZ WTS Analytical Instruments)的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室重新測(cè)量了各種 96 孔板，得出了光路徑長(zhǎng)度范圍的中間值。然后將該值代入以下方程式，就可以將 96 孔板測(cè)試中使用的起效光密度值轉(zhuǎn)換為適用于 Eclipse 平臺(tái)的等效起效光密度值。
用上面的計(jì)算公式以及 96 孔板和 Eclipse 微孔板的實(shí)測(cè)路徑長(zhǎng)度，算出表 1 中的光密度值，用于 Eclipse 軟件。
我們并排測(cè)試了 96 孔板和 Eclipse 微孔板的光密度值，確認(rèn)這兩種平臺(tái)的所有的內(nèi)毒素、PPC、%CV(變異系數(shù))值都是等效的。如果鱟試劑生產(chǎn)商提供了光密度值范圍，則重新計(jì)算整個(gè)范圍，然后在 SieversEclipse 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)試。兩種平臺(tái)的所有范圍之間的等效性都得到確認(rèn)，從而證明數(shù)值轉(zhuǎn)換是正確的，生成的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。
如果您的實(shí)驗(yàn)室使用各種起效光密度值，建議您進(jìn)行測(cè)試，確定哪個(gè)值適用于各個(gè)樣品，因?yàn)楫?dāng)測(cè)試完畢后，就無(wú)法在 Sievers Eclipse 軟件中更改起效光密度值。表 1 可以幫助您確定適用于您的樣品的等效光密度值。
結(jié)論
雖然 Eclipse BET 平臺(tái)和 96 孔微孔板的起效光密度值不同，但我們可以用現(xiàn)成的物理方程式來(lái)精確計(jì)算出它們的等效值，因此用戶可以放心使用 Eclipse 平臺(tái)測(cè)量出來(lái)的內(nèi)毒素結(jié)果。如需詳細(xì)的指導(dǎo)，請(qǐng)向您所在地的 Sievers 業(yè)務(wù)代表或應(yīng)用專家查詢。
參考文獻(xiàn)
1.McCullough, Karen Zink. The Bacterial Endotoxins Test: A PracticalApproach. DHI Publishing, LLC, 2011.
2.Helmenstine, Anne Marie. Beer’s Law Definition and Equation.ThoughtCo, 2019.
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