以下是傳統檢測過程中遇到的一些挑戰：

過去，內毒素檢測并不像今天這樣。多年來，它已經從家兔熱原試驗演變為今天常用的動力學方法。現代實驗室中常用的動力學方法之一是動態顯色分析法。在進行動態顯色分析前，必須先完成幾個步驟和檢測，以確保產品可以用這種方法進行分析。這些步驟通常在開發和發布一種新產品、過渡到新的鱟試劑供應商或更改為新的藥典方法時使用。

必須先完成幾次計算，才能確定如何分析產品并認為產品可以安全使用。計算內毒素限值、最大有效稀釋度（MVD）和/或最小有效濃度（MVC）以確保產品不會對患者造成不良影響，并且可以按照法規要求進行適當的分析。美國藥典USP<85>，USP<1085>，AAMI標準和其他法規準則提供了確定這些值的公式和進一步指南。這些計算可以手動完成，也可以借助某些具有這些計算能力的內毒素軟件進行。

研究發現大多數藥品都會在一定程度上干擾（抑制或增強）細菌內毒素檢測，但由于鱟試劑檢測具有很高的靈敏度，通?？梢酝ㄟ^在水中稀釋內毒素來克服這些干擾。在計算出內毒素限值和MVD之后，必須完成一項研究以確定克服干擾（DROI）所需的稀釋度。這項研究通常稱為方法適用性或產品表征，它以高達MVD并可能包括MVD的多種稀釋度分析產品。

在此過程中，將密切監控陽性產品對照（PPC）的回收率，以尋找可能發生的任何潛在抑制或增強作用。PPC回收率用于確定待分析產品的最佳稀釋度。應當使用每種稀釋液的幾份重復樣來完成這項研究，以證明其可重復性，并考慮到微孔板制備過程中可能發生的任何誤差。如果已經證明很難通過僅用水稀釋BET來克服產品中的重大干擾，則可以采取以下措施：使用可替代的鱟試劑、熱失活（在蛋白質存在下），使用特異的Tris或內毒素特定緩沖液，或用1 mM螯合劑（EDTA）稀釋。

一旦確定了DROI和潛在的樣品預處理，就必須使用相同的鱟試劑供應商和方法對至少三個批次的產品進行檢測，以確認其有效性。QC實驗室通常會在軟件外部跟蹤對三個批次的分析，但某些內毒素軟件可以跟蹤產品驗證，查看每批經過驗證的產品并簽署產品驗證。這些軟件功能可以使結果井井有條且易于訪問，從而加快驗證過程。

除了產品特性研究外，在建立并驗證平臺后，必須對所使用的鱟試劑進行確效。這至少要使用三種內毒素濃度，這些濃度要超過鱟試劑生產商所述的范圍，每種濃度的至少使用三份重復樣進行檢測。必須對每批新的鱟試劑完成該檢測，以確保其適合使用。

無論是完成方法適用性測試、鱟試劑批次確認，還是常規檢測，最耗時的步驟是微孔板本身的設置。要確保96孔微孔板或凝膠檢測設置沒有任何污染或移液錯誤，對精確度和專注度的要求非常高。對于傳統的96孔微孔板，即使是最熟練的分析員，整個板的設置時間也可能需要一個小時以上。即使方法適用性基于生化基礎，這種冗長的設置過程也會導致效率低下。檢測一個樣品需要用另一個鱟試劑供應商的配方來重復其適用性，這很容易將過程延長到幾天或幾周才能完成，而QC實驗室可能沒有這個能力。目前很少有創新的解決方案可以幫助QC實驗室簡化這一過程，但近期開發的先進的自動化功能可以大大節省時間和簡化程序。

一旦完成產品驗證或鱟試劑確認，就可以建立常規檢測方案，以簡化每日和每周的檢測需求。一些軟件可以協助這一過程，使分析員能夠創建檢測模板，在登錄后可快速訪問，立即開始檢測，從而減少設置時間并增加樣品檢測量。

細菌內毒素檢測看上去令人望而卻步，需要遵循許多步驟，完成許多批次的檢測以確認檢測方法可行，而以上也僅是內毒素檢測所要面對的挑戰中的一個部分！還需要對分析員進行全面的培訓，實驗室必須進行正確設置和維護，且所有過程都必須把合規性放在重位。使用自動化和軟件來減少內毒素檢測的壓力和負擔，以減輕QC實驗室內分析員和管理人員的日常工作壓力。

本文作者：Sydney Jannetta（Sievers分析儀生命科學產品應用專家），原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2021年1-2月刊，本文有所修改。