熒光定量PCR實驗中CT值出現異常的原因分析

     熒光定量PCR是生物醫學中常用的檢測核酸病毒的方法之一，由此，這幾年PCR 儀也成了近幾年臨床檢測和分子生物學研究的主要實驗室設備。 我們知道CT值是PCR 擴增曲線中的重要參數，那么CT值是什么？它與 PCR擴增存在什么關系？為什么有的時候基因擴增實驗中會出現 CT 值異常甚至缺少CT值的情況？

什么是CT值？

     在熒光定量PCR擴增實驗中，當擴增產物的熒光信號（Fluorescence signal）達到設定的熒光閾值（FLUORESCENCE threshold）時的所對應的擴增循環數（Cycle Threshold）。也可以理解為在qPCR實驗過程中初始模板擴增到一定產物量值時，所對應的循環數。 CT 值的表達公式為：擴增產物量=起始模板量×（ 1+En）循環個數。

通常QPCR實驗中CT值的異常主要有以下幾種情況：

 一、擴增曲線正常，CT值偏大或偏小

從CT值表達公式中我們可以看出初始模板的質量和擴增效率，會直接影響到CT值的大小。 如果擴增起始模板量濃度高或引物設計不合適那么所用的循環數就會小，即出現Ct值過?。环粗鹗寄０辶繚舛冗^低，Ct值會偏大。 PCR擴增效率與 CT 值也是成反比關系，擴增效率高則CT值小，擴增效率低則需要要用到的循環數增加所對應的CT值也會偏高。另外，合理的引物設計，防污染試劑的應用也會影響到CT值的大小。

二、 有擴增曲線，但卻沒有CT值，CT值顯示狀態為Undetermined

這種情況下你通常也會發現由于閥值位置不正常正常導致熒光閾值線與擴增曲線沒有交點，所以儀器顯示狀態為Undetermined。出現這種如果擴增模板濃度是正常的，那么多數原因可能是由于系統界面參數設置錯誤所導致的。如果參與擴增的模板并非所有的孔，而系統界面在所有的 （ C-H行）都默認 設上了target和 sample 參與CT值計算。這個時候系統會默認所有孔參與熒光定量 PCR 實驗 。導致CT值錯誤。如果我們把無樣品C-H 行 數的target和sample 前面的“√" 清除 后重新分析計算，就會得到正常的熒光閾值線 C T 值了。

三、 有擴增曲線，閾值線的位置也正常，但大多數孔仍然不顯示CT值。

當系統界面C-H行 顯示出現異常提示（比如黃色三角形標示），在數據分析中會再很多孔內出現 BLFAIL提醒。這表明基線分析失敗，如果確定我們在反應物中加了熒光染料，如果加了，那么這種 熒光值偏低現象，可能由于使用了透光性不好PCR 耗材或不配套的耗材所導致。這種情況較容易出現在底部或側邊掃描檢測的PCR 儀器中；朗基的 Q2000系列采用的頂部CCD 實時檢測技術甚至可以用*不透明的白管進行實驗，所以一般不會存在這種問題。

四、 還有一種情況較為常見也就是擴增曲線不正常，CT值都顯示“Undetermined"。 

此時，如果在熒光定量PCR檢測報告頁面出現了ROX的熒光值 為0的情況，很可能是使用了不含ROX 試劑而系統參數中未做修改所造成，及時在分析設置中將 Passive reference dye的ROX 改成None，再重新分析即可正常顯示。有些沒有ROX 校正的PCR 儀中也較容易出現此類問題。 

從上面Qpcr實驗中常幾種常遇到的幾種情況中可以看出：要想獲得 準確的pcr實驗結果，實驗的設計及樣本、配套試劑耗材、儀器類型的選擇、正確的軟件操作等都與實驗本身密不可分。

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