使用EBV 表達細胞轉化淋巴細胞的方法？

EBV，也稱為人類皰疹病毒 4，是淋巴隱病毒屬的一種伽馬皰疹病毒. 它是傳染性單核細胞增多癥的原因，并與多種人類腫瘤疾病有關，包括伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。大多數成年人的 EBV 血清反應呈陽性，表明其在人群中普遍存在。感染通常是潛伏的。然而，外植的淋巴瘤細胞有時會產生傳染性病毒。幾十年前，來自淋巴瘤外植體的細胞系的上清液被用于確認 EBV 感染的腫瘤潛力，這是通過病毒介導的細胞培養中人血 B 淋巴細胞的永生化。從那時起，B 淋巴細胞的 EBV 體外轉化已成為獲得用于診斷和研究人類細胞系的常規程序。

一、實驗材料的準備：

1.二甲基亞砜 (DMSO)

2. 培養基

 IMDM、RPMI-1640、胎牛血清

3.抗生素

青霉素/鏈霉素溶液，10,000 IU/mL 青霉素，10,000 μg/mL 鏈霉素 ( ATCC 30-2300 )

4.PBS緩沖液，不含鈣和鎂

5.來自 EBV 表達細胞的過濾上清液

6.經輻照的 MRC-5 貼壁細胞

注意：經輻照的 MRC-5 細胞包裝為冷凍懸浮液，每瓶 1 毫升。每個小瓶足以接種高達 225 cm 2的表面積（9 - T-25 燒瓶）

二、生物實驗器材的準備

凍存管

去纖維蛋白或抗凝劑處理的全人血

Histopaque-1077 Ficoll 梯度溶液或Sigma-Aldrich 

25 cm 2 (T-25) 細胞培養瓶，細胞培養處理

75 cm 2 (T-75) 細胞培養瓶，細胞培養處理

15 mL 無菌聚苯乙烯離心管，帶蓋

實驗目的：使用EBV 制劑 轉化您的B 淋巴細胞從而獲得 VR-1492。

實驗時的注意事項：

所有工作都應在 BSL-2 條件下使用無菌技術完成，并使用處理血液制品的通用預防措施。B95-8 細胞還可能攜帶和分泌一種可傳播的 D 型逆轉錄病毒，松鼠猴逆轉錄病毒 – B95-8 (SMRV-B95-8)，它可以感染人類 B 和 T 細胞系。這種逆轉錄病毒不會干擾 EBV 的轉化能力。

實驗步驟：

1.將 0.1 mL DMSO 分配到標記的冷凍管中用于血液儲存。

2.從容器中匯集去纖維蛋白或抗凝劑處理過的血液。

3.每個凍存管分配 0.9 mL 的血液，定期混合以確保均勻的細胞懸浮液。蓋上小瓶并輕輕混合。

4.在 -80°C 的乙醇中將小瓶冷凍在冷凍保存容器中 3-18 小時，或以每分鐘 1°C 的速度冷凍。

5.將冷凍保存的血液小瓶儲存在液氮中。

6.在用于轉化前 1-5 天準備飼養層。

7.通過將 FBS 添加到 EMEM 或 IMDM 到 10% v/v 和青霉素/鏈霉素溶液到 1% v/v (1X) 來制備完整的培養基。

8.解凍一瓶經輻照的 MRC-5 單層細胞，并在無菌 50 mL 錐形管中與 27 mL 完整培養基混合。

9.每個 T-25 燒瓶（~4 × 10 5 個  細胞）分配 3 mL 細胞懸浮液。 

10.第二天用顯微鏡檢查培養瓶。理論上應該是大約 30% 重合。

注意：培養后1-5天用于轉化。

淋巴細胞處理步驟：

1.準備用于轉化的淋巴細胞

2.將 3 mL 的全血（新鮮或解凍）與等體積的 PBS 或 RPMI-1640 混合。

3.使用 Ficoll 從紅細胞和粒細胞中分離淋巴細胞。

4.在 15 mL 聚苯乙烯離心管中，將稀釋的全血小心地鋪在 4.5 mL 的室溫 Histopaque-1077 上。

5.在室溫下以 400 × g 離心 40 分鐘。

6.取出并丟棄上層透明等離子層，使其距離中間層0.3 cm 2以內。

7.將中間層的不透明淋巴細胞帶和 Histopaque-1077 層轉移到管底部顆粒的0.3 cm 2 內，轉移到新的 15 mL 離心管中。

8.用含 20% FBS 和青霉素/鏈霉素的 IMDM 填充管；將試管充分混合并以 260 × g 離心 15 分鐘。取出并丟棄上清液

9.用 10% FBS 和青霉素/鏈霉素在 10 mL IMDM 中重新懸浮細胞顆粒；以 260 × g 離心 15 分鐘，混合并收集細胞。取出并丟棄上清液。

10.用 10% FBS 和 1X 青霉素 /鏈霉素在 3 mL IMDM 中重新懸浮細胞顆粒。

11.使用染料排除方法對所得淋巴細胞制劑進行可行計數。

12.立即使用細胞進行轉化或將它們冷凍以備將來用于全血。

三、設置轉化培養物（建議每個樣品使用 2 個培養瓶） 

1.每個轉化瓶解凍 1 瓶人類 gammaherpesvirus 4 (HHV-4) ( VR-1492) (1 mL) 。 

2.從飼養層中取出培養基。

3.  每瓶需要添加：2 毫升 IMDM 與 20% FBS；1 mL 淋巴細胞懸液，含有 1-6 × 10 6淋巴細胞；1 毫升（1 瓶）人伽馬皰疹病毒 4 (HHV-4) (ATCC VR-1492)。

4.在 5% CO 2濃度下， 37°C 混合培養，持續觀察轉化細胞的培養物

5.啟動后 7 天，觀察每個燒瓶的轉化跡象并添加 4 mL 新鮮培養基（ IMDM，含 20% FBS 和 1X 青霉素/ 鏈霉素）。

6.淋巴細胞轉化的早期跡象包括錐形細胞、具有尖峰狀突起的細胞和具有折射性的、看起來健康的細胞簇。

7.轉化的后期跡象包括培養物的濁度增加和培養基的酸化，表現為變黃。

8.此后每 3-4 天，檢查培養物是否有轉化跡象并添加新鮮培養基。

9.小心地取出 3-4 毫升培養基而不去除細胞。

10.加回相同體積的*培養基（含 20% FBS 和 1X 青霉素 /鏈霉素的 IMDM）。

11.擴大轉化培養物以建立淋巴母細胞系

12.將細胞從密集的 T-25 搖瓶瓶轉移到 T-75 搖瓶，并添加足夠的 IMDM 和 10% FBS 和青霉素/鏈霉素，以獲得每毫升 1-3 × 10 5細胞的細胞密度。

13.通過添加培養基，將 T-75 搖瓶中的細胞密度保持在每毫升1-3 × 10 5 個細胞。

14.擴展到額外的燒瓶以將細胞密度保持在 1-3 × 10 5細胞/mL。

15.以每毫升3-5 × 10 6 個細胞的速度冷凍轉化細胞以供保存和以后使用

16.完成活細胞計數以確定懸浮液中細胞的密度和活力以及保留待冷凍的細胞總數。

17.通過以 260 × g 離心 15 分鐘從培養液中收集細胞。

18.丟棄上清液并將細胞顆粒重新懸浮在一定體積的冷凍冷凍介質中（IMDM，含 10% FBS 、青霉素/鏈霉素和 10% DMSO），細胞密度為每毫升3-5 × 10 6 個細胞。

19.將產生的細胞懸浮液分配到標記的冷凍管中。

20.將小瓶在乙醇中的冷凍保存容器中在 -80°C 下冷凍 3-18 小時，或以每分鐘 1°C 的速度在受控速率冰箱中冷凍，然后將它們儲存在液氮中。

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