Trizol試劑的使用方法

該法從細胞中提取RNA--用勻漿器將組織磨碎，加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿，以每分鐘12000轉離心5分鐘，樣品即分成水樣層、中間層和有機層。

※RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。

※在除去水樣層后，中間層中的DNA和蛋白質也能相繼以沉淀的方式還原:乙醇能使中間層的DNA沉淀析出，在中間層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質。

每100ml TRIzol可以抽提100個六孔板中的樣品或100個50-80mg的組織樣品。無論樣品是人、動物、植物還是細菌組織，該方法對少量的組織(50-100mg)和細胞(約五百萬個)及大量的組織(≥1g)和細胞(超過一千萬個)均有較好的分離效果。

每一百萬細胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA(產量因細胞和組織不同而異)。

TRIzol操作上的簡便性允許其同時處理多個樣品，所有的操作可以在一小時內完成。

TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質的污染，故而能夠作RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和單分子克隆(PCR)。

※如果是用于PCR，當兩條引物位于單一外顯子內時，建議用級聯擴大的DNase I(Cat. No. 18068)來處理抽提的總RNA。

※TRIzol試劑能促進不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA經過瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7kb和15kb之間的不連續的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分)，兩條優勢核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時，其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時宜-70℃沉淀過夜。

TRIzol對人體有害，使用時應戴一次性手套，注意防止濺出。

⒈樣品的制備 當樣品富含蛋白質，脂肪，多糖或是細胞外物質例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2-8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質，余下的沉淀中包含有細胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。在來自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應該除掉。在每一個個案中，將清亮的勻漿溶液轉移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續進行下述的分離步驟。

⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2-3分鐘。在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。

⒊ RNA的沉淀 將水樣層轉移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 ml TRIZOL對應0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10分鐘并在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。

4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2-8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。

⒌ RNA的再溶解 在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀(空氣干燥或真空干燥5-10分鐘)不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55-60°C下孵育10分鐘(當RNA以后要用于酶切反應時，避免使用SDS。)RNA還能被100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在–70°C。