CCK-8細胞活性檢測實驗步驟
CCK-8實驗可用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。使用酶標儀在450nm波長處測OD值，可間接性反應活細胞的數量。使用CCK-8試劑盒進行細胞活性檢測是一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。
CCK-8細胞活性檢測實驗步驟：
一、實驗前準備：
酒精燈、移液槍、酶標儀（帶有450nm濾光片）、96孔培養板、CO2培養箱、CCK-8、細胞計數板、PBS等。
二、繪制曲線
1.制備細胞懸液：選取生長狀態良好的對數生長期細胞制作細胞懸液，并計數。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ：按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做5-7個細胞濃度梯度（比如，稀釋10倍，100倍......），每組4-6個復孔。
3.繪制標準曲線：接種后培養一定時間待細胞貼壁后，然后每100μL培養基加10μL（10%）CCK-8試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標，OD值為縱坐標的標準曲線。
根據此標準曲線可測定出未知樣品在條件一致的前提下的細胞數。
標準曲線還有助于確定細胞接種的合適數量以及摸索CCK-8后所需孵育時間。
三、細胞增殖檢測
1.制備細胞懸液：選取生長狀態良好的對數生長期細胞制作細胞懸液，并計數。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ：根據合適的鋪板細胞數（根據自身的細胞類型而定，以一周能鋪滿為宜，若為血液細胞密度可適當增大），每孔接種約100ul細胞懸液，每組設置4-6個復孔。
①當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個/孔(100μl培養基)。懸浮細胞由于染色比較困難一般需要增加細胞數量和延長培養時間。
②當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。為減少誤差，最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培養液，不作為測定孔用。
③接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不一致。3.將培養板置于培養箱中預培養（37℃，5% CO2）12-24小時，使細胞達到指數期（培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異）。
4.每孔加入10ul CCK-8試劑
①由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議直接配置含10% CCK-8培養基（現用現配）以換液的形式加入。注意加CCK-8試劑時不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數。加CCK-8試劑時速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入CCK-8試劑后輕輕震培養板。
②加CCK-8試劑時間可分別在22h、46h、70h、94h時加入，也可以在24h、48h、72h、96h時再加入。重要的是需保證實驗組和對照組在同一時間點進行實驗。
③若細胞培養時間較長，培養基顏色或 pH 發生變化，建議更換培養基后再加 CCK-8。5.將培養板置于培養箱內繼續培養0.5-4小時①培養時間因孔中細胞的類型和數量而異，需要自己摸索，因為細胞種類不同，形成Formazan的量也不一樣。
②如果顯色太淺的話，可以將96孔板置于37℃細胞培養箱中繼續培養，可參考標準曲線確定培養時間。
③一般情況下，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（最多 4 h）或增加細胞數量。
④CCK-8 的反應時間以具體顯色的適宜時間為準。可在0.5h、1.0h、2.0h分別觀察培養基的顏色。最佳OD 值控制在1.0左右較合適。6.使用酶標儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）。實驗重復3次，取實驗結果的平均值作為最終實驗結果。
空白對照的設定：在同體積的培養基中加入CCK-8，培養同樣的時間，和實驗組一起測定450nm的吸光度。
①使用酶標儀檢測時記得打開96孔板蓋子，需保證酶標板的表面以及板底是干凈的，且每個待測孔內沒有氣泡，以免干擾實驗結果。
②如果結果出現“overflw"則需降低細胞接種密度，如果因實驗需要不能減少細胞數時可縮短加入CCK-8后的培養時間。
③如果樣品為高渾濁的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。（CCK-8 在參比波長處沒有吸光值，設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。）
④若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。
蘇州阿爾法生物提供的酶標儀、移液槍、Co2培養箱、顯微鏡、細胞計數儀等實驗室設備和酶標板、96孔板、離心管、PCR八聯排管、移液槍吸頭等實驗耗材以及CCK-8試劑盒、PBS緩沖液、培養基等生物試劑用于CCK-8細胞增殖檢測。
