生命科學(xué)研究中常用的幾種實驗方法

生命科學(xué)研究時生物學(xué)的分支，下面介紹幾個關(guān)于生命科學(xué)常用的幾種實驗方法：
一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度

實驗原理：BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法測定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合，并將其還原成Cu1+。Cu1+和BCA試劑反應(yīng)使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm有強(qiáng)烈的光吸收，且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此可用于蛋白質(zhì)濃度測定。

二、免疫組化

原理:免疫組織化學(xué)，即免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理一-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、翻、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原《多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。常用于免疫組化實驗的有組織石蠟切片、組織冰凍切片、細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片。

三、RNA提取（Trizol法）

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

四、RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。

實驗步驟主要包括：1、RNA的提取；2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；3、PCR擴(kuò)增；4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。

五、實時熒光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR ）

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。

閾值：是循環(huán)開始3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期。

C(t)值：熒光信號（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。
 

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