貼壁細胞傳代培養的基本步驟

  我們知道開始培養的細胞不能無限期地生長，因為受限區域內的細胞數量不斷增加，營養物質也會被消耗，從而 導致有毒的代謝產物增加，另外根據實驗或生產需要，也要對細胞進行 擴大培養。通過去除培養基并將細胞轉移到新鮮的生長培養基和基質中，細胞獲得了新鮮的營養并去除了有毒代謝物，從而可以長期維持培養。這個過程就屬于傳代培養，傳代培養的 細胞 密度會低于原始培養物中的細胞密度。當接種細胞后， 細胞生長會經過滯后期、對數期，穩定期 和凋亡期。在凋亡期，細胞會因缺乏營養或培養條件不當而死亡。貼壁細胞傳代培養步驟如下：
一、細胞檢查
  細胞解凍后需要進行細胞狀態檢查，確保細胞生長狀態正常，確保無細菌污染、無支原體污染。培養貼壁細胞時，主要貼壁于培養皿或燒瓶底部，培養基呈粉橙色。由于培養基中細胞（或污染）的代謝產物酸化，pH 指示劑酚紅變黃。MDCK 細胞在對數生長期呈多邊形，單層生長。使用正常的明場照明很難看到它們。通過切換到相襯，可以更容易地識別細胞。
記錄細胞狀態對于確保實驗結果一致非常重要。通過活細胞成像儀可以通過遠程控制輕松成像和保存。研究人員可以拍攝細胞圖像以跟蹤培養狀態并將圖像傳輸到智能設備或 U 盤。


二、細胞收獲
1.將培養基從細胞中吸出到廢物容器中。也可以使用連接到瑞寧的真空吸液器。
2.用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的預熱 PBS 小心洗滌細胞最多 3 次，以去除殘留培養基中的胎牛血清 (FBS)。FBS 或 FBS 替代品會抑制胰蛋白酶。加入 3 ml 含EDTA的胰蛋白酶并輕輕晃動覆蓋貼壁的細胞并在 37°C的水浴鍋中孵育并解離細胞。 不同的細胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時間。為避免過度胰蛋白酶消化會損壞細胞，請每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次。
3.輕輕沖洗板并將細胞懸浮液轉移到 50 ml 試管中，并以 800 rpm 的速度向下旋轉 5 分鐘
分離的細胞應呈圓形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。一旦細胞分離，向培養皿中加入 5 ml 培養基以使胰蛋白酶失活。
4. 分離的細胞應該是圓形的并且在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。
三、細胞計數
1. 由于臺盼藍可以選擇性地穿透死細胞的細胞膜將死細胞染成藍色，所以使用臺盼藍溶液染色有利于觀察細胞的活力。根據這一特點我們將100UL細胞懸浮液與100UL的 0.4% 的臺盼藍溶液混合均勻后，再進行細胞觀察。
2.將移液器吸頭放在蓋玻片邊緣并輕輕排出細胞懸浮液，從而將細胞懸浮液裝入計數室（每個計數區約 4 µl）。蓋玻片下的區域通過毛細管作用填充。
3.將細胞計數板放在細胞計數儀中進行細胞計數。

四、稀釋
1.將所需體積的細胞（適當數量的細胞）以所需的分流比（此處為 1:10）吸取到新培養皿中，然后用培養基將其加滿至每個培養皿中所需的體積（10 毫升）。注意培養皿蓋上的細胞類型、細胞分裂日期和傳代數。將細胞放回 37°C 的培養箱中。
2.以所需的分流比將所需體積的細胞（適當數量的細胞）移入新培養皿中。
讓細胞過夜以恢復和沉淀。24 小時后，用顯微鏡檢查細胞的形狀、粘附和是否存在污染。
3.細胞應該附著在培養皿底部并且已經開始生長和分裂。更換培養基以去除任何殘留的解離劑或細胞碎片。培養細胞直到它們融合并準備好進行實驗或下一次傳代培養。
4.細胞應當附著在培養皿底部并開始生長和分裂。
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