流式細胞技術介紹

  流式細胞技術是一項廣為使用、基于激光的生物學技術，利用流式細胞儀對處于 快速流動的熒光染色的細胞或生物顆粒進行多參數、快速的定量分析和分選，是當代主要的細胞定量分析技術之一。主要有以下幾個特點：
1.只要樣本制成單個細胞或生物顆粒懸液均可以分析。
2.測量速度快，每秒鐘可以測量數千個乃至數萬個細胞
3.同時測量每個細胞的多參數特征。
4.在進行細胞特征分析的同時可以把有特征細胞分離出來(分選技術)
關于流式細胞儀
流式細胞儀由三部分構成——
1.液流系統，包括流動室和液流驅動系統；
2.光學系統，包括激發光源和光束收集系統；
3.電子系統，包括光電轉換器和數據處理系統。

流式細胞儀工作原理
流式細胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經熒光標記的細胞或微粒逐個 通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉換成分別代表前向散射角、側 向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和加三維結構圖像進行分析。
目前臨床中運用流式細胞儀進行外周血白細胞、骨髓細胞以及腫瘤細胞等的檢測，是臨床檢測的重要組成部分。

流式細胞術基本原則
1.使各種液體和懸浮細胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；
2.針對不同的細胞樣本進行適當洗滌、酶消化或 EDTA 處理，以清除雜質，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態；
3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯用酶消化法，機械打散法和化學分散法來獲得足夠數量的單細胞懸液；
4.對石蠟包埋組織應先切成若干40-50um 厚的蠟片，經二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細胞懸液；
5.單細胞懸液的細胞數不應少于10000個。 
 
實驗步驟
1.制備單細胞懸液
將待測細胞或微粒制成單細胞懸液，經特異性熒光染料標記抗體進行染色。在恒 定氣體的壓力下進入流動室，不含細胞或微粒的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出。 鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束。待測細胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依冷通過檢測區域。
2.其次，收集單細胞上的熒光信號
流式細胞儀通常以激光作為發光源，經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流 上，細胞或微粒上的熒光染料被激發，產生散射光和激發熒光。光散射信號在前 向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方 向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
3.再次，統計結果
熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原強度或細胞內物質的濃度，經光電轉 換變為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處
理，將分析結果顯示在計算機上。
4.最后，做細胞分選
細胞的分選是指根據所測定的各個參數將細胞從細胞群體中分離出來的 一種方式，通過分離含有單細胞的液滴實現。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。 
流式細胞技術的應用
1.其測定細胞內DNA 的變異系數最小， 一般在2%以下；
2.能準確地進行DNA 倍體分析；
3.借助于熒光染料進行細胞內蛋白質和核酸的定量研究；
4.快速進行細胞分選和細胞收集；
5.醫學應用：免疫功能研究各種干細胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細胞功能 及代謝動力學研究，血小板分析(心血管疾病),流式細胞術與分子生物學研究；
6.應用于外周血內皮細胞測定、調節性T 細胞等領域。
 
流式細胞儀的應用
(一)、檢測細胞凋亡
1.亞 G1 峰檢測：凋亡細胞雙鏈 DNA 發生裂解導致染色質濃集。 DNA 降解后，形
成長度為180-200bp 的 DNA 片段，成為凋亡小體。而常規壞死的DNA 分解是隨機的， DNA 片段大小不一，在流式細胞檢測上可出現比亞二倍體 (G1) 峰更小的細胞碎片峰。
2.Annexin V/PI雙染色法：當細胞發生凋亡時， PS (磷酯酰絲氨酸)從細胞膜內 轉移到細胞膜外，使 PS 暴露在細胞膜表面， Annexin V 具有易于結合 PS 的磷 脂結合蛋白。因此，建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指標并 結合一種染料排出試驗已檢測細胞膜的完整性的檢測方法。該法使用 FITC 標記AnnexinV, 同時結合使用PI標記細胞核。
3.JC-1 染色法檢測線粒體膜電位： JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態。低濃度 時，以單體存在，可檢測到綠色熒。,用流式檢測時，通常為 FL-1 通道。高濃度 時，以多聚體存在，可檢測到紅光，流式檢測通常為 FL-2 通道。細胞膜電位正 常時，JC-1 通過線粒體膜極性進入線粒體內，并因濃度升高而形成發射紅色熒光 的多聚體。而凋亡細胞，線粒體跨膜電位去極化， JC-1 從線粒體內釋放，濃度降 低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式。故而可以通過檢測綠色和紅色熒光檢測線粒體膜電位的變化。