菌種保存常用的五種方法

各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長(zhǎng)期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：

1.斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完成后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。

放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個(gè)月左右，無(wú)芽孢的細(xì)菌可保存1個(gè)月左右，酵母菌可保存3個(gè)月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長(zhǎng)。

此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時(shí)也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對(duì)經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。

2.石蠟油封藏法

此法是在無(wú)菌條件下，將滅過(guò)菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無(wú)毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。

由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會(huì)干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長(zhǎng)。這種方法操作簡(jiǎn)單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對(duì)霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長(zhǎng)達(dá)10年。但對(duì)很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。

有試驗(yàn)指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報(bào)道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時(shí)菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。

3.甘油懸液保藏法

此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡(jiǎn)便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用-20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可達(dá)10年。

將擬保藏菌種對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。

4.凍干保藏法

冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保藏。常用的保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。

由于此法同時(shí)具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長(zhǎng)，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。

5.液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏法簡(jiǎn)稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。美國(guó)ATCC菌種保藏中心采用該法時(shí)，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min的速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過(guò)快，由于細(xì)胞內(nèi)自由水來(lái)不及滲出胞外，形成冰晶就會(huì)損傷細(xì)胞。據(jù)研究認(rèn)為降溫的速度控制在（1～10）℃/min，細(xì)胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應(yīng)提高。

液氮低溫保藏的保護(hù)劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑，再通過(guò)試驗(yàn)加以確定保護(hù)劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。

此法操作簡(jiǎn)便、高效、保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前菌種長(zhǎng)期保藏主要技術(shù)之一。除了少數(shù)對(duì)低溫?fù)p傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動(dòng)物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點(diǎn)是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，無(wú)論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點(diǎn)是需購(gòu)置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。

要使用菌種時(shí)，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無(wú)菌操作打開(kāi)安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時(shí)速度要快，一般不超過(guò)1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。并且取樣時(shí)一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。

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