單層細胞系傳代培養指南

大多數細胞系和原代細胞培養物生長為單一厚度的細胞層（單層）或附著在玻璃或經過特殊處理的塑料基質上的薄片。為了保持培養物的健康和積極生長，通常需要定期對它們進行傳代培養。

   常見的傳代培養方法涉及通過使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶或膠原酶）破壞細胞間和細胞與基質的連接。在細胞解離成主要由單細胞組成的懸浮液后，將它們稀釋并轉移到新的培養容器中。在那里它們可以重新附著并開始生長和分裂，經過一段時間的孵化后再次接近匯合。此時，它們可以再次進行傳代培養或用于實驗。

   以下指南描述了典型單層細胞培養的常規傳代和維護所涉及的基本原則。為了獲得一致的結果，保持良好的記錄很重要。記錄應包括細胞傳代日期和傳代次數。

細胞周期性檢查

定期仔細檢查培養物以確定其狀態和健康狀況是一種很好的做法。用肉眼檢查培養容器中的內容物，尋找微生物污染的宏觀證據，例如意外的 pH 值變化或培養基中的濁度和顆粒。還要尋找通過顯微鏡可能不容易看到的小真菌菌落。這些菌落可能漂浮在介質-空氣界面上，尤其是在容器邊緣周圍。

其次，使用倒置顯微鏡檢查一般細胞形態和生長模式。仔細尋找微生物污染的任何微觀證據。在某些細胞系中，漂浮在培養基中的細胞是細胞死亡的標志。然而，許多細胞在有絲分裂期間聚集，形成非常折射（明亮）的球體，如果培養物受到物理干擾，這些球體可能會自由漂浮。死細胞通常會聚集并分離，但通常不會折射。

除了這些日常檢查外，定期培養細胞進行真菌和細菌檢測，并檢測支原體污染情況。有幾種方法可用于檢查這些污染物。有關支原體檢測試劑盒和細胞培養試劑的信息，請參閱蘇州阿爾法生物實驗器材網站。

準備培養基

準備推薦用于細胞系的新鮮培養基，并適當標記培養容器。一定要添加補充劑并平衡 pH 值。在一個 75 cm 2 的燒瓶中，使用大約 12 至 15 mL 的培養基。相應地調整其他培養容器的體積。

收獲細胞

大多數細胞培養物如果在達到匯合之前進行傳代培養（仍然有一些可用的生長空間），則生長最好。這將有助于使細胞保持在活躍的對數生長期。應始終在為每個細胞系維護的記錄表上注明任何異常觀察結果。收集步驟旨在將細胞從其基質中去除，并盡可能溫和地破壞細胞間的鍵合。對于大多數細胞培養，這需要在緩沖鹽水溶液中使用化學或酶解離劑。

  胰蛋白酶 是常見的解離劑，通常以 0.05% 至 0.25% 的濃度使用。適宜工作濃度通常是通過使用min濃度的胰蛋白酶來確定的，該胰蛋白酶會在相對較短的時間內（10 到 15 分鐘的孵育）從基質中去除細胞并產生單細胞懸浮液。有些細胞比其他細胞更難分離，因此胰蛋白酶溶液經常添加酶（如膠原酶）或螯合劑（如 EDTA）以改善結果。

    在含有哺乳動物來源血清的培養基中生長的細胞需要洗滌以去除血清，因為胰蛋白酶會受到其存在的抑制。殘留血清通常是胰蛋白酶溶液無法將細胞與底物和彼此分離的原因。有多種緩沖鹽溶液可用。通常是基于Hanks 緩沖鹽水溶液、Earle 緩沖鹽溶液或 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽溶液的改進。如果要將這些制劑用于解離細胞，通常會將這些制劑修改為不含鈣和鎂 (CMF-PBS)，因為這兩種離子在細胞與細胞和細胞與基質的附著中起著重要作用。

收獲單層細胞的步驟 

1.取出并丟棄培養基。

2.用 5 mL 的解離溶液沖洗細胞片并取出。（本協議中使用的量適用于 75 cm 2燒瓶；對于其他容器中的培養物，按比例減少或增加量。）如果解離溶液含有胰蛋白酶，則去除所有痕量的血清非常重要，其中含有胰蛋白酶抑制劑。

3.添加 2 至 3 mL 的解離溶液。每 5 分鐘用倒置相差顯微鏡檢查一次酶處理的進度。特別難以分離的單分子層可置于 37°C 以促進分散。酶溶液的預熱也會縮短暴露時間。為避免結塊，在等待細胞分離時不要通過敲打或搖動燒瓶來攪動細胞。

4.使用移液器將 6 至 8 mL 生長培養基添加到細胞懸浮液中，并從培養容器底部清洗所有剩余的細胞。此時，倒置顯微鏡的快速檢查應顯示細胞懸浮液由至少 95% 的單細胞組成。5.如果不是這種情況，則可能需要更劇烈的移液。

6.收集細胞懸浮液，根據需要計數或分種接種物，然后分配到準備好的培養容器中。對于某些細胞系和酶溶液（膠原酶），有必要在分配（接種）細胞之前通過溫和離心（125 × g 5 分鐘）去除酶。

計數細胞或分裂懸液

 為了確定生長速率或建立已知濃度的培養物，有必要對懸浮細胞進行計數?？梢允褂醚毎嫈灯骰螂娮蛹毎嫈翟O備。血細胞計數器的優點是價格較低，同時可以進行存活率測定。

  輕輕混合細胞懸浮液并取出 0.5 mL 等分試樣進行計數。向其中添加 0.5 mL 用于細胞計數的重要染色劑，例如臺盼藍或赤蘚紅 B?；旌暇鶆?，取出樣品，然后小心地裝入干凈的血細胞計數器。

    確定細胞懸浮液的實際濃度（細胞數/mL）和存活率百分比，并計算以適當密度接種每個傳代培養物所需的懸浮液體積。懸浮液通常不計數細胞，而是分散在多個培養容器中。例如，1:2 拆分意味著將一個容器的細胞懸浮液分成兩個新容器，通常具有相同的表面積。這種方法適用于細胞系的日常維護，其中跟蹤準確的細胞密度并不重要。 

平板培養

將細胞懸浮液的適當等分試樣分配到準備好的容器中（將濃縮細胞懸浮液添加到空培養容器中會導致細胞附著和生長不均勻）。生長較快的培養物通常在較低濃度下建立。除非最初添加min濃度的細胞，否則一些培養物不會生長良好。然而，大多數培養物在 10 3到 10 4 個細胞/cm 2或更高（7.5 × 10 4到 7.5 × 10 5個細胞/75-cm 2燒瓶）的初始濃度下會茁壯成長。 

重新培養培養物

將培養物放回振蕩培養箱中。大多數哺乳動物細胞培養物在 35°C 至 37°C 之間的穩定溫度下表現較好。除了保持恒定溫度外，用于培養皿和多孔板等未密封培養物的培養箱還必須保持高濕度和二氧化碳水平。高濕度減少了未密封培養容器中的蒸發損失，這會導致培養基變得高滲并對細胞造成壓力。如果與含有適量碳酸氫鹽的緩沖系統一起使用，升高的二氧化碳水平（通常為 5% 至 10%）有助于維持適當的 pH 值（7.0 至 7.6）。

   為了使這種類型的緩沖系統起作用，有必要使用未密封（松開的蓋子）或透氣的培養容器進行氣體交換。如果沒有CO 2 ，緩沖系統可以在密閉容器中保持適當的 pH 值。

   第二天檢查培養物以確保細胞重新附著并活躍生長。根據需要更換介質；對于大多數活躍生長的培養物來說，更換周期為約為每周 2 到 3 次。

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