hTERT 永生化腎上皮細胞培養方法

    血管平滑肌脂肪瘤是腎臟的良性腫瘤，起源于假定的血管周圍上皮樣細胞。這些細胞可能會分化成具有黑素細胞、平滑肌或脂肪細胞特征的細胞。然而，血管平滑肌脂肪瘤的研究因缺乏成熟的血管平滑肌脂肪瘤衍生細胞系和良好的動物模型而受到限制。 hTERT 永生化腎上皮細胞來源于血管平滑肌脂肪瘤，因此研究人員現在可以在體外利用這些細胞的原代細胞特性和延長的壽命。
   UMB1949 細胞系  表達 NG2 和 L1，并且在塊蛋白 (Tsc2) 的外顯子 33 中有一個確定的 5bp 缺失，在塊蛋白（和/或錯構蛋白）中有突變。因此，該細胞系可用于研究結節性硬化癥的信號轉導和藥物效率。SV7tert PDGFtu1細胞系來源于 SV7tert 植入裸鼠引起的腫瘤。SV7tert 細胞系是一種非致瘤性血管平滑肌脂肪瘤細胞系，通過編碼 PDGF-BB 的逆轉錄病毒進行轉導，使 SV40 大 T 抗原和人端粒酶永生化。腫瘤來源的細胞分泌的 PDGF 比植入前細胞多 18 倍，并表現出自分泌轉化和表觀遺傳變化。
細胞培養方案
用單克隆泛細胞角蛋白抗體（綠色）和 Hoechst 染料（藍色）染色的 CRL-4004。
所需材料
Dulbecco 改良 Eagle 培養基 (DMEM)
胎牛血清
Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水
胰蛋白酶-EDTA 溶液（HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）
細胞培養測試的 DMSO
培養基
hTERT 永生化腎上皮細胞可以使用加入10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養。冷凍細胞的處理程序和培養的啟動
為確保高水平的活力，解凍小瓶并在收到后盡快開始培養。如果到達后需要儲存冷凍培養物，請將小瓶儲存在液氮蒸氣中，而不是-70°C。在 -70°C 下儲存會導致活性喪失。
有關從每批 ATCC 腎上皮細胞中回收的活細胞總數，請參閱產品信息表最后一頁上提供的批次特定信息。
1可以使用配置好的培養基，如需在培養基中添加培養基添加劑需要注意保證培養基的PH保持在7.0-7.6之間。注意培養基的酸堿度變化。
2.在 37°C 水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。為減少污染的可能性，請將 O 形圈和蓋子遠離水。解凍應該很快（大約 2 分鐘）。
3.一旦內容物解凍并通過浸入或噴灑 70% 乙醇進行凈化，立即將小瓶從水浴中取出。從這一點開始的所有操作都應在嚴格的無菌條件下進行。
4.將小瓶內容物轉移到含有 9.0 mL 培養基的離心管中，并以大約 125 xg 的速度將細胞懸浮液離心 5 至 7 分鐘。
5.棄去上清液，將細胞稀釋后在在細胞搖瓶中懸浮培養。
6.在 37°C、5% CO 2加濕培養箱中孵育培養物。
細胞的傳代和維護
注意：
為避免結塊，在等待細胞分離時不要通過敲擊或搖動燒瓶來攪動細胞。置于 37°C 以促進分散。
1.通過每 2 到 3 天更新一次培養基來維持培養中的細胞。
2.有關細胞傳代培養的濃度，請參閱產品信息表。當確定細胞已準備好進行傳代培養時，繼續下一步。
3.取出并丟棄介質。
4.用 Dulbecco 的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗細胞以去除血清痕跡。
5.向燒瓶中加入 2.0 至 3.0 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞，直至細胞層分散（通常在 5 至 10 分鐘內）。
6.添加 6.0 至 8.0 mL 的生長培養基，并通過輕輕移液吸出細胞。
7.將細胞懸浮液轉移到 15 mL 離心管中，并以大約 125 xg 的速度旋轉 5 至 10 分鐘。
細胞的維護
1.丟棄上清液并在新鮮生長培養基中重懸細胞。將適當的細胞懸浮液等分試樣添加到新的培養容器中。有關推薦的接種濃度，請參閱產品表。
2.在 37°C、5% CO 2加濕培養箱中孵育培養物。
細胞凍存時的注意事項
可以使用已補發細胞凍存液，也可以使用95% 培養基+5% DMSO進行細胞凍存。避免直接將細胞浸入液氮液相中。

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