從微生物和細胞中中分離線粒體的基本步驟方法

在人體內，線粒體是我們身體的“能量中心"，它們可以將營養物質轉化為ATP等可用能源。除了在人體內外動植物細胞中都能發現線粒體存在。通過從微生物和細胞中分離出線粒體，我們可以更好地了解其內在機制和功能。在本文中，我們將介紹從微生物和細胞中分離線粒體的基本步驟方法。

 什么是線粒體

  自20世紀初被發現以來，線粒體一直被認為是細胞內部的主要能量儲備所在。線粒體是由兩個膜界限組成的可變形的類囊體結構，在其內側膜中包含酶群，參與三磷酸腺苷(ATP)的形成。線粒體可進一步劃分為許多結構不同的亞種，這些亞種通過形態和功能上的區別進行分類。盡管對線粒體的研究日趨深入，但分離線粒體的技術仍然是研究員工常常需要掌握和精通的技術。

從微生物中分離線粒體的基本步驟方法

在微生物中，將細胞產物進行相對簡單地分離是較為容易的。關鍵的問題在于如何有效地純化線粒體并且增加其穩定性以進行更加深入的研究。

一、所需材料

l 酵母培養

l 冷凍離心機

l 15 毫升離心管

l 氯化鈉 (0.9%)

l 微量移液器

l 冰冷裂解緩沖液

l 搖床

l 線粒體儲存緩沖液

l 冰箱

l 15 ml 微量離心管

二、從微生物（酵母細胞）中分離線粒體的步驟方法：

1. 將過夜酵母培養物無菌轉移到兩個 15ml 離心管中。

2. 在 4°C 下以 500g 離心 10 分鐘。

3. 小心去除上清液，不要干擾沉淀。

4. 使用微量移液器在 1ml 氯化鈉 (0.9%) 中小心沖洗沉淀。

5. 使用微量移液器丟棄離心管中的氯化鈉。

6. 將沉淀重懸于 1ml 冰冷的裂解緩沖液中，并使用微量移液器充分混合。

7. 在 4°C 的搖床上孵育 10 分鐘。

8. 在 4°C 下以 1000g 離心 10 分鐘，小心去除上清液。

9. 將細胞沉淀重懸于 1.5 ml 冰冷的破碎緩沖液中，并使用針頭的鈍端完成細胞破碎。

10. 將裂解物在 4°C 下以 1000g 離心 10 分鐘。

11. 將上清液轉移到新鮮的 15mL 管中，并混合從步驟 7 中獲得的上清液。

12. 在 4°C 下以 6000g 離心 10 分鐘并棄去上清液。

13. 用線粒體儲存緩沖液清洗顆粒。

14. 在 4°C 下以 6000g 離心 20 分鐘。

15. 將沉淀重懸在線粒體儲存緩沖液中并儲存在 -20°C。

三、從細胞培養物中分離線粒體

1.所需的生物試劑/實驗試劑

l 1 升冷 STE，具有以下成分：

l 250 毫米蔗糖 = 85.58 克/升

l 5 毫米 Tris = 0.606 克/升

l 2 毫米 EGTA = 0.76 克/升

l 使用 4?C milliQ實驗室純水，pH 值至 7.4，使用 2 M HCl，置于冰上

2. 從細胞培養物中分離線粒體的具體方法

1. 在 3 x 500 cm2 組織培養板中使細胞生長至 85-95% 匯合度

2. 在生長時，吸出所有培養基。

3. 用 30 ml 冷 STE 清洗細胞單層，吸掉所有 STE

4. 用 30 ml 冷 STE 清洗第二次并吸出

5. 使用干凈的刀片從板表面刮下細胞單層

6. 將刮下的細胞重懸于 5 ml 冷 STE 中并轉移至離心管 (50 ml) 中。重復兩次。

7. 對所有組織培養板重復步驟 2-6，將細胞匯集到離心管中（每 1 個托盤 1 個管）。

8. 在 4?C 2000 rpm 下旋轉細胞 10 分鐘。

9. 小心吸出上清液（沉淀略微擴散）并保留細胞沉淀。

10. 在含有蛋白酶抑制劑和 0.5% 無脂肪酸 BSA 的 3.5 ml 冷 STE 中重懸細胞沉淀，轉移到冷的 7ml 玻璃-聚四氟乙烯勻漿器中。用 1.5 ml 含 0.5% 無脂肪酸 BSA 的 STE 洗滌試管，然后轉移至勻漿器。

11. 通過“緊密"柱塞緩慢通過 10 次使細胞勻漿，并將勻漿轉移到 50 ml 離心管中。如果需要，加滿冰冷的 STE。

12. 將勻漿在 4?C 下以 3000 rpm 的轉速旋轉 3 分鐘（1 管）

13. 通過雙層濕棉布過濾上清液，并在 4?C 下以 10000 rpm 的轉速旋轉 11 分鐘（2 管）

14. 倒出上清液并擦拭管內壁。

15. 在冰冷的 STE 中重懸線粒體沉淀，并轉移到 15ml 離心管中。加入冰冷的 STE 并以 11,600 G 旋轉 10 分鐘。

16. 使用冷試管作為杵將線粒體顆粒重新懸浮在殘留的上清液中。

17. 將線粒體放在冰上。

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