SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗步驟

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態下，每克多肽可與1.4g去污劑結合。

當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳常用試劑及設備

試劑：蛋白值樣品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%過硫酸，5×SDS-PAGE電泳緩沖液，考馬斯亮藍R-250染色液，脫色液、天能預制膠。

儀器耗材：垂直電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，移液槍，移液槍tip吸頭，離心管、試劑瓶。

實驗步驟

一、凝膠配置

1．分離膠的配制

（1）找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏；

（2）若膠板不漏水，就進行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中，混勻（1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大）；

（3）將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分（不要將濾紙塞到膠板底部）；

（4）小燒杯中再加入TEMED，混勻。（TEMED可使膠凝固，所以最后加）；

（5）灌膠：混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產生氣泡；

（6）用水將分離膠壓平（用水灌滿，同時加水時要緩慢加入，防止把膠吹起）。

也可以直接使用預制膠，預制膠直接拆開即用，不用配制。

2．濃縮膠的配制

（1）待分離膠與水中間形成明顯的橫線，即分離膠凝固。隨后進行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中；

（2）將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分（盡量不要把濾紙插入）；

（3）小燒杯中再加入TEMED，混勻；

（4）灌膠。然后插入梳子；

（5）把制膠器倒過來，膠仍然不會往外流，或可以明顯看出梳子中兩個齒之間的膠面明顯凹下去，說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內，并在電泳槽內加入SDS-PAGE電泳緩沖液，把膠浸泡一段時間，時間越長越好（防止梳子與膠相連，或膠因濕度不夠而縮減）；

（6）點樣時，再把梳子拔出來，拔時動作要輕，防止膠齒被拔斷。

二、SDS-PAGE電泳步驟

1、調膠：拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調整齒的位置（使它們都平行）。

2、點樣：用20µL的小槍頭，吸煮過的樣品10µL，對準膠孔點樣，注意不要把樣品點在外面。使用適當的分子量蛋白marker。

3、電泳：電泳儀正負極接好，打開電源。濃縮膠：電壓 low 100V，分離膠：電壓 high 150V。

4、卸膠：等膠內的所有的藍色都跑出去，電泳停止，一般時間為1-2小時左右。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開，膠的濃縮膠部分割除；

5、染色：放入考馬斯亮藍R-250染色液中進行常溫過夜染色；

5、脫色：將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進行脫色，直到背景發白。

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