使用PCR儀進行基因擴增的實驗方法

實驗室常用 DNA 聚合酶有三種：TaqTM ， EXTaqTM  和  Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶， 保真性較差 ， 但價錢便宜， 一般用于基因表達的檢測等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading  活性的耐熱性 DNA 聚合酶， 具有一定的保真性， 而且其擴增得到的 PCR 產物 3 ’ 端附有一個 “A" 堿基 ，如果希望直接將產物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐熱性 DNA 聚合酶， 其特點是保真性高，擴增得到的 PCR 產物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。

1.   按下列組成在 PCR 反應管中調制反應液：

TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方

merase 的配方

① 反應總體積根據實際情況進行調控，可以做 20~50µl 以節約試劑；

② 將上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 滅菌的 PCR 薄壁管中；

③ 如果不用 PCR 儀的加熱蓋，在反應混合液的上層加 30 ~50µl  的礦物油防止樣品在 PCR 的過程中蒸發；

2.   按以下程序進行 PCR 擴增。

PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異， 在實際操作中需根據具體的情況以及 PCR 結果而進行優化。

反應結束后，抽取擴增樣品 5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，用 DNA marker 判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

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