大腸桿菌質粒 DNA 的提取（堿裂解法）

此方法適用于小量質粒DNA 的提取提取的質粒 DNA 可直接用于酶切PCR 擴增。

1.   取 1.5ml 細菌培養物于 EP 管中， 4000rpm  離心 1 分鐘， 棄上清液， 使細菌沉 淀盡量干燥；

2.   將細菌沉淀重懸于用冰預冷的 100 μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖， 10 mmol/L EDTA pH 8.0 ，25 mmol/LTris-HCl pH 8.0)  中，劇烈振蕩；

3.   加入 200 μl 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH ，1％SDS（m/v）)，蓋緊 EP 管 口，快速顛倒離心管 5 次，以混合混合物，確保離心管的整個內表面與溶液 II 接觸，不要渦旋，置于冰浴中；

4.   加入 150 μl 預冷溶液 III(每 100 ml  的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L   乙酸鉀，11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)，蓋緊 EP 管口，反復顛倒數次，使溶液 III 在粘稠 的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 3~5 分鐘；

5.   在最大轉速下離心 5min，取上清液于另一新 EP 管；

6.   用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈 DNA，振蕩混合于室溫放置 2 分鐘， 最大轉 速離心 5 分鐘；

7.   小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；

8.   加 1ml 70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用 12,000g 離心 2 分鐘，棄上清，將 開口的 EP 管置于室溫使乙醇揮發， 直至 EP 管中內沒有可見的液體存在（5 ~ 10 分鐘），用適量的 ddH2O 溶解；

9.   用 0.5μl 的 RNase 37℃溫育 5~10 分鐘；

10. 電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA

1.    加入 1/10 體積的乙酸鈉（3mol?L，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混勻， 使其 最終濃度為 0.3 mol?L；

2.    加入 2 倍體積用冰預冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中 15~30 分鐘；

3.    12,000 g 離心 10 分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.    加入 1/2  離心管容量的 70％乙醇， 12000g  離心 2 分鐘， 小心移出上清液， 吸 去管壁上所有的液滴；

5.    于室溫下將開蓋的 EP 管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發至干；

6.    加適量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。

酶  切

1.   酶切前確定待切樣品的濃度,  并選擇合適的限制性內切酶和配套 Buffer。 2.   在離心管中加入如下成分：

10 ×Buffer     1μl

待切樣品  xμl

酶        0.5-1μl

加水補足 10μl

3.   混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.   將離心管置于 37℃中溫育 1-3hr，若待切樣品為 PCR 產物， 則可將反應時間 適當延長。

5.   用未酶切的質粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。

注：當酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當加大反應體積。雙酶 切可選用二者活性都較高的 Buffer 或者通用 Buffer，但要注意不能有星反應。）

連 接

1.   連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。

2.   在離心管中加入如下成分：

10 ×連接 Buffer 1μl

待連接的樣品（膠回收產物或 PCR 產物，載體與片段的 mol 比為 1∶3-5）

連接酶 0.5-1μl                                                                            

加水補足 10μl

3.   混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4.   將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當的時間（根據不同公司的酶的要求

而定， 一般為 22℃ 1-3hr 或 16℃連接過夜）。

連接完的樣品可直接用于轉化，也可放 4℃冰箱短期保存。