蛋白純化親和層析原理

下圖中圓球表示載體,球上黑色箭頭表示配基。當各種不同功能的高分子物質(分別以方塊、半圓和三角缺口來表示配基結合部位)通過時,只有帶三角缺口的高分于物質能與固相上的配基專一結合，其它高分子物質則不受阻礙地流出，然后改變洗脫條件使分離目的物解離而洗脫下來。

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2，蛋白純化親和層析載體簡介

三，親和吸附和洗脫

   純化蛋白質的親和層析基本用柱法。在上柱時應選擇配基和目的物之間作用的離子強度和pH組成,使最有利于形成親和絡合物，一般則選取中性pH作為吸附條件。樣品應溶于親和層析柱的平衡緩沖液中,或用平衡緩沖液進行透析。上柱速度盡可能慢，對溫度不敏感的物質，室溫純化即可；對溫度敏感的物質，可以采用在4℃下純化，通常的親和層析圖譜如下圖。

     樣品上柱后分離目的物先緊密地吸附在親和柱上,用平衡緩沖液洗滌時層析譜上出現第一個雜蛋白的峰。繼續用大量平衡緩沖液充分洗滌，必要時用不同緩沖液洗滌以除去非專一吸附的雜質,使柱上只留下專一吸附的目的物。然后改變緩沖液，要求選擇能減弱純化目的物與親和吸附劑之間吸附力的條件,使絡合物解離洗出，圖譜上出現第二個峰。一般洗脫方法是改變緩沖液的pH，改變離子強度或同時改變兩者。洗脫蛋白質大多數用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀鹽酸，如果目的物會被酸破壞，可使用0.1mol/L氫氧化銨洗脫。蛋白質洗出后應立刻中和、稀釋透析、重折疊為天然結構恢復蛋白質活性。

      除改變緩沖液pH作為洗脫方法以外，尚有用可溶性配基作競爭性洗脫。例如用較高濃度的抑制劑、輔酶或底物,競爭洗脫酶。用各種糖或低聚糖苷從固定化的植物凝集素親和吸附系統上洗脫專一吸附的糖蛋白目的物。用這類洗脫劑的優點還在于它又一次地利用了生物專一性。但這種洗脫方法所得蛋白質溶液往往較稀，并含有可溶性洗脫劑，這可以用透析和凝膠過濾法除去。有些抗原和抗體結合力特別強，上述方法有時尚不能洗脫則可試用鹽酸胍、尿素等蛋白促溶劑作為洗脫劑，洗脫的蛋白在適當處理后能恢復活力者才適用。當分離目的物洗脫下來后可連續使用大量洗脫液洗滌親和柱，再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡，經過這樣處理，親和柱就可以重復使用。

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