細胞轉染方法之-磷酸鈣沉淀法

【實 驗 原 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法。磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可以在細胞內進行瞬時表達，也可整合到靶細胞的染色體上從而產生不同基因型和表型的穩定克隆。該方法可廣泛用于轉染許多不同類型的細胞。

【儀器、材料和試劑】

（一）儀器、用具

CO2培養箱^[1]、10cm細胞培養平板、巴斯德吸管、微量移液器^[2]、15ml錐形管、燒杯、量筒等。

（二）材料

呈指數生長的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質粒DNA

（三）試劑

1．培養基

DMEM 90ml

FCS 10ml

2．2M CaCl2，過濾除菌，-20℃保存備用

3．2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

用NaOH調pH至6.95，過濾除菌后，-20℃保存備用。

【方法與步驟】

1．在10cm的培養板上接種1×106個BALB/c 3T3細胞

第二天進行轉染

2．準備CaPO4沉淀

2.1 準備兩組試管

在A管中加入： 15μg質粒DNA

69μl 2M CaCl2

460μl重蒸水

在B管中加入： 550μl 2×HEBS

2.2 用巴斯德吸管將A管中的溶液緩慢地逐滴加入在B管中，同時用另一吸管吹打B管溶液，整個過程需緩慢進行，至少需持續1～2min。

2.3室溫靜置30min，出現細小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養細胞的10cm平板中，輕輕晃動（此過程需盡快完成）。

4. 在5%CO2的加濕培養箱中培養細胞2-6 hr。

5. 除去培養液，加入10ml培養基培養細胞1-6天（依具體情況而定）。

6. 收集細胞進行基因活性的檢測，或分散接種到其他培養皿中進行選擇培養。

【注 意 事 項】

1．在整個轉染過程中要保持無菌操作。

2．在實驗中使用的各種試劑都必須小心校準，保證質量。

3．質粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉淀后的DNA應保持無菌，在無菌水或Tris- EDTA中溶解。

4．沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地黏附和進入細胞。

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