質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染真核細胞方法有哪些？

質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染真核細胞方法有哪些？質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染真核包主要有以下兩種方法：

1．生化方法
（1）磷酸鈣介導的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細胞
1）轉(zhuǎn)染前 24 h，通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)呐囵B(yǎng)基以1×105至4×105細胞 /cm2的密度平鋪細胞于60 mm組織培養(yǎng)皿或12孔板上。于含 5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20 ～24 h。轉(zhuǎn)染前1 h換液。
2） 按照下屬方法制備磷酸鈣 -DNA沉淀：于5 ml滅菌塑料管內(nèi)混合100μl 2.5 mol/L CaCl2與 25μg質(zhì)粒DNA，如有必要用0.1×TE（ pH7.6）將體積補至1 ml。室溫下將以上2×鈣 -DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合。迅速彈敲試管側(cè)壁混勻溶液，靜置1 min 。
3）立即將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中。每1 ml 培養(yǎng)基加0.1 ml懸液。輕輕搖動平皿混勻培養(yǎng)基，培養(yǎng)基會變成混濁的橘黃色。一旦形成DNA沉淀，轉(zhuǎn)染效率會大大降低，因此此步動作應盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與 /或丁酸鈉處理細胞，直接進行步驟5。
4）如果轉(zhuǎn)染的細胞不用轉(zhuǎn)染促進劑處理，則置于含 5%~7%CO2的37℃溫箱孵育。2～ 6 h后，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀。加入5 ml 37 ℃預熱的培養(yǎng)基，將細胞放回孵箱孵育1～6天。繼續(xù)步驟 6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達，或者如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化則直接進行步驟7 。
5）在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細胞或者吸去沉淀溶液后將細胞暴露于甘油與丁酸鈉中會促進細胞吸收 DNA。 
（2）用氯喹處理細胞
氯喹是一種弱堿，推測是通過抑制細胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA 而發(fā)揮作用（Luthman and Magnusson 1983）。細胞對氯喹毒性的敏感度限制了培養(yǎng)基中加入氯喹的濃度及時間，不同細胞所需氯喹最佳濃度根據(jù)經(jīng)驗而定。
1 ）在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞前或后按1： 1000將100 mmol/L氯喹直接加入培養(yǎng)基中。
2）細胞于含 5%~7%CO2的37℃溫箱中孵育3~5 h。
3）在用DNA于氯喹孵育細胞后，移去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加 5 ml預熱的培養(yǎng)基。細胞于孵箱中培養(yǎng)1～6 天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達，或者直接進行步驟 7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
（3）丁酸鈉處理細胞
丁酸鈉的作用機制并不確定；但它是組蛋白乙酰化形成使外來質(zhì)粒DNA趨于轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（Workman and Kingston 1998 ）。
1）甘油休克處理后，將500 mmol/L丁酸鈉直接加入生長培養(yǎng)基（甘油處理的步驟 d）。細胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他細胞系所需濃度依經(jīng)驗而定。
2）細胞于孵箱中培養(yǎng)1~6 天。繼續(xù)步驟6檢測轉(zhuǎn)染DNA 的瞬時表達，或者直接進行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
6）若要檢測細胞轉(zhuǎn)染后導入 DNA的瞬時表達，可在轉(zhuǎn)染后1~6天收獲細胞。雜交分析 DNA或RNA。通過體內(nèi)代謝標記進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
7）分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體
(1)用非選擇性培養(yǎng)基孵育細胞24~48 h ，使轉(zhuǎn)染的DNA有足夠時間表達。 
(2) 胰酶消化細胞并重鋪細胞于選擇性培養(yǎng)基中，或者直接加選擇性培養(yǎng)基/
(3)每 2~4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2~3周，目的是清除死細胞殘骸，促進抗性細胞生長。
(4)克隆獨立菌路、繁殖，以用于檢測（方法見《細胞試驗手冊》的第 86章]）。
(6)用預冷的甲醇固定細胞15 min ，然后室溫下用10% Giemsa染色 15 min，流水沖洗，這樣可以記錄細胞克隆數(shù)目。

2．物理方法
（1）電穿孔轉(zhuǎn)染DNA
1）細胞生長到對數(shù)中期或晚期時收集細胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細胞。 4℃、500g離心5 min（Sorvall H1000B 轉(zhuǎn)子用1 500r/min）.
2）用0.5 體積的初始培養(yǎng)基重懸細胞，用血細胞計數(shù)器計細胞數(shù)目。
3）離心（同步驟1）收集細胞，室溫下用培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液重懸細胞至2.5×106~2.5×107 細胞/ml。
4）將400μl的各等份細胞懸液（ 106～107細胞）加入標記好的電轉(zhuǎn)化池中，冰浴。
5）設置電轉(zhuǎn)化參數(shù)。一般電容量為1050μF 。電壓在200 V和250 V之間，不同細胞系所需電壓不同，平均為260 V 。內(nèi)部阻抗設為無窮大。進行電穿孔前先用一個裝有PBS的電轉(zhuǎn)化池放電至少兩次。
6）每一裝有細胞的電轉(zhuǎn)化池內(nèi)加入10 ～30μg、體積最大可至40μl的質(zhì)粒DNA 。用吸管將DNA與細胞輕輕混勻。立刻繼續(xù)進行第7步。 
7）立即將電轉(zhuǎn)化池移至電極間放電， 1～２min后，取出電轉(zhuǎn)化池，水浴，立即進行下一步操作。
8）用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細胞轉(zhuǎn)移至 35 mm培養(yǎng)皿中。用等體積的培養(yǎng)基洗滌電轉(zhuǎn)化池，洗液加入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿置于含5%～7% CO2 的37℃孵箱。
9）重復第6 ～8步，電轉(zhuǎn)化所有DNA與細胞樣品。記錄下每一電轉(zhuǎn)化池的實際脈沖時間以便于比較。 
10）如要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，直接進行第11步。如果是瞬時表達，則于電穿孔24 ～96 h后用下述方法之一檢測細胞：
*如果使用的是表達E.coli β- 半乳糖苷酶的質(zhì)粒DNA，檢測細胞裂解液中酶活性。
*如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在450~490 nm 光照下用顯微鏡檢測細胞。
*如果使用其它基因產(chǎn)物，則通過體內(nèi)代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
11）分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體：用培養(yǎng)基培養(yǎng) 48~72 h后，胰酶消化細胞，用適當?shù)倪x擇性培養(yǎng)基重鋪細胞。每2~4天換液一次，持續(xù)2~3 周，目的是去除死細胞殘骸，并允許抗性細胞克隆生長。

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