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多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題
多孔細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時同樣遵循嚴(yán)格無菌的原則，各項操作要保證規(guī)范、科學(xué)，不對細(xì)胞的生長造成額外的影響。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。
多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的加樣和操作：
細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時同樣遵循嚴(yán)格無菌的原則，各項操作要保證規(guī)范、科學(xué)，不對細(xì)胞的生長造成額外的影響。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。
問：
96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細(xì)菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進(jìn)去呢？
答：
蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣(實際上是為了使培養(yǎng)皿外的CO2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值)。
凡事有利必有弊，這樣當(dāng)然增加了污染的可能性。此外這樣還會使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā)，這對于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔(定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱)b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽)。
就好像培養(yǎng)皿，也是一個蓋倒扣的容器，也不會污染。主要是因為蓋子“L”型邊緣產(chǎn)生氣流負(fù)壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負(fù)壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴(kuò)散，不會產(chǎn)生氣流，所以只會透氣不會透菌。
問：
使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺內(nèi))，而其他孔中還有細(xì)胞要培養(yǎng).我很擔(dān)心這樣會污染，不知道要注意什么?
答：
在超凈臺內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的，我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其他孔用蓋子蓋起來。
使用前綜合考慮一下，充分使用所有的孔；如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住，我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔(右手加樣方便)。
操作時用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高，不要把蓋子全打開，一般沒問題。
細(xì)胞分布不均及解決辦法
問：
細(xì)胞接種培養(yǎng)板，細(xì)胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？
答：
請問你的細(xì)胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細(xì)胞中間少，四周多！
這里提供一個好辦法：在培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個小時的飽和后再取出，種入細(xì)胞時力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細(xì)胞就會想你說得那樣聚積在一起。
培養(yǎng)板孔直徑愈小，這個現(xiàn)象越明顯，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因為液體的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液，使得細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話，這要看你需要觀察何種指標(biāo)，如果是MTT，免疫組化的話會因為細(xì)胞成層而影響結(jié)果。
消化細(xì)胞時要注意吹打均勻，避免細(xì)胞成團(tuán)，而且孔內(nèi)培養(yǎng)液量要足夠，一般接種時加足量培養(yǎng)液，加干預(yù)時換一次液，干預(yù)液加培養(yǎng)液量等于接種時培養(yǎng)液量，這樣的話“邊集”現(xiàn)象會有所改觀，不妨一試。
問：
我做的是空斑形成實驗，最好是細(xì)胞鋪成均勻的一層，，可接種病毒時大部分孔都還好，個別的不太均勻。細(xì)胞組內(nèi)差異很大，想請教一下大家加細(xì)胞的時候都有什么方法呀？
答：
細(xì)胞消化后吹打成單細(xì)胞懸液很關(guān)鍵！保證分板時每個孔的細(xì)胞數(shù)目是一致的！
當(dāng)然還有處理因素各個孔之間的平行也很重要，比如說加藥時，藥物稀釋后混勻，保證每個孔的濃度是一致的！
再者加細(xì)胞和藥物時，要試驗組和對照組一塊輪流加，避免加樣先后順序?qū)е录?xì)胞密度和藥物濃度的差異！
問：
吹打已經(jīng)是均勻了，但是鋪板，6孔，24孔總有些不均勻，有點往中間集中。而且明明計數(shù)好了鋪，長一兩天，各個孔密度又不一樣，對檢測有影響，有良策嗎？
答：
如果用巴氏吸管鋪的話，每次吸取的量不要太多，因為吸管內(nèi)的細(xì)胞會自動向下沉，往往第一開始幾個孔細(xì)胞數(shù)多，經(jīng)常均勻細(xì)胞懸液，加液走S型路線。
如果用移液器的話，tips要處理下，把去掉避免損傷細(xì)胞，這樣每一次取液對應(yīng)一個孔。用tip一對一孔加入比較準(zhǔn)確。但也要注意混勻懸液。
設(shè)立平行組，n要足夠大(可以計算一下)。
鋪板后不要搖，因為搖動會導(dǎo)致細(xì)胞向中間聚集。最好鋪板一次搞定。