細胞基本信息

 細胞正常生長形態

細胞名稱：Hi-five(昆蟲細胞)

細胞別稱： BTI-Tn-5B1-4；BTI-TN-5B1-4; BTI-TN5B1-4; BTI-Tn5B14; BTI-Tn 5B1-4; Tn-5B1-4; Tn 5B1-4; Tn5 B1-4; Tn5B1-4; TN5B14; TnH5; High Five; High 5; High-5; High5; Hi-5; Hi5; Tn-5

細胞貨號： SNL-191

生長特性： 半貼壁

培養條件： Grace's Insect Medium（Supplemented）+10%FBS+1% P/S

培養環境：空氣，100%；

細胞簡介： Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細胞是由武漢大學生命科學學院胡遠揚教授提交保藏。Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細胞是一株昆蟲細胞，主要用于昆蟲病毒的擴增、病毒與宿主細胞相互作用的研究等。

Hi-five(昆蟲細胞)特點

1、細胞靜置培養時半貼壁生長，也可以使用搖瓶懸浮培養

靜置培養時細胞會大量附著瓶底生長，呈半貼壁狀態，會有少部分細胞懸浮生長；

搖瓶培養時可以很快適應懸浮生長，呈單個或小聚團懸浮生長；

2、對溫度極為敏感

細胞于26-28℃空氣培養，需要盡量控制溫度，保證細胞生長狀態；

若溫度低于26℃，細胞生長速度會變慢，但恢復溫度后生長速度會逐漸恢復，不會對細胞產生過大傷害；

若溫度28℃-30℃，細胞生長嚴重受限；若溫度高于30℃，細胞將受不可逆傷害導致無法使用，即使溫度恢復也無法恢復正常生長狀態；

同時注意使用的培養基、PBS及其他試劑應復溫至室溫（最好26-28℃），盡量減少觀察細胞次數和時間；

3、細胞對吹打、氣泡等機械損傷敏感

細胞操作時若吹打力度過大、氣泡過多將嚴重影響細胞生長狀態，導致細胞后續存活率降低，注意操作輕柔；

4、細胞可以適應多種培養體系

該細胞多用于真核細胞蛋白表達系統，因此針對該細胞有諸多培養體系，例如Grace's Insect Medium、SF900 II、TNM-FH、ESF921等培養體系，包括含血清的培養體系和不含血清的培養體系，可以根據自身實驗需要選擇逐步更換為合適的培養體系；

5、細胞對吹打、氣泡等機械損傷敏感

細胞操作時若吹打力度過大、氣泡過多將嚴重影響細胞生長狀態，導致細胞后續存活率降低，注意操作輕柔；

 6、細胞凍存存活率不高

實際實驗過程中，尚恩發現Hi-five細胞疑似表現出較低的凍存保存能力，凍存后活率會隨保存時間增加而逐漸下降，因此若有持續培養該細胞或者需要快速復蘇進行實驗需求的實驗室建議定期復蘇培養細胞并重新凍存以保證細胞凍存活性不會下降至無法接受的范圍；

7、細胞貼壁培養后可能會伸出觸角

細胞在貼壁培養時，一周左右會有部分細胞伸出較長觸角，同一個培養瓶培養時間越長，有觸角的細胞可能越多，這是細胞自然現象，非細胞交叉污染或狀態不佳；

細胞收貨攻略

常溫細胞

1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放28℃培養箱靜置2-4h；

2.吸走大部分培養基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續培養至細胞密度80%以上再進行傳代培養；

凍存細胞

1.細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰揮發建議立即復蘇細胞并聯系銷售人員解決；

2.凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3.復蘇一管細胞出現異常及時聯系銷售人員，在專業技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips

1.細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰揮發等異常情況時，及時拍照聯系銷售人員；

2.該細胞貼壁生長，一般T25瓶運輸過程中較少出現大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態，不影響細胞生長，按正常操作步驟繼續培養即可。

3.尚恩生物T25瓶發貨的細胞內含對應細胞的培養基，可以收集原裝培養瓶內培養基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

細胞傳代攻略

1.輕輕拍打培養瓶背面，使細胞松動，吸取瓶內培養基輕輕吹打細胞面使細胞脫落，少量未脫落的細胞可以留著繼續培養；

2.收集細胞懸液，混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

3.加3-5ml PBS重懸細胞，再次混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

4.加新的培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里，補足培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養；

Tips

1. 注意操作輕柔，盡量降低吹打力度、避免產生氣泡；

2. T25瓶加10-12ml培養基，10cm皿加12-15ml，30%密度4-5天換液一次，30-50%密度3-4天換液一次，50-80%密度2-3天換液一次，80%以上每天換液；

3. 細胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續培養可以視具體細胞生長狀態和密度情況決定傳代比例；

4. 傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細胞凍存攻略

凍存步驟

1.先將細胞按傳代步驟收集離心，至傳代步驟3，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；

2.加入適量預先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至做好標記的凍存管中；

3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

4.轉移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips

1.檢測凍存細胞活性結果未合格前，培養瓶內細胞建議繼續培養直至確認凍存合格方可視需要丟棄；

2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產品說明書處理降溫過程；

3.T25培養瓶長滿通常可以凍存2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；

細胞復蘇攻略

復蘇步驟

1.將所需的培養基放在培養箱預熱30min后開始復蘇；

2.準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；

3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉速會有差異；

4.離心完成后棄凍存液，用剛才預熱的培養基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養箱；

5.24h后觀察細胞并換液一次，放回培養箱繼續培養；

Tips

1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮蒸發后再水浴；

2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內離心細胞，避免再次轉移細胞；

5.復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

常見問題及解決方案

1、細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態的一種方式；

NO.2培養過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3懸浮培養需要怎么操作？

本公司Hi-five細胞自適應懸浮培養，基本無需訓化。 需要懸浮培養前需保證細胞活性90%以上，收集細胞懸液，以1x10⁷細胞/ml的密度接種至搖瓶中培養即可。搖瓶培養轉速跟實際條件相關，尚恩使用轉速約100rpm/min，客戶可以根據自身實驗室情況選擇合適的轉速（通常80-150rpm之間）。

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