細胞因子（如IL-2、TNF-α、IFN-γ等）是免疫系統中的關鍵信號分子，其活性通常用EC50（半數最大有效濃度）來評估。EC50是指細胞因子達到最大生物學效應一半時所需的濃度，值越小，表明活性越強。
細胞因子EC50通常使用細胞增殖檢測、報告基因檢測、流式檢測、ELISA檢測、生物傳感器及其他方法，下面我們一一介紹相關方法。
01 細胞增殖檢測法（經典生物學活性檢測）
（采用 Balb/C 3T3 細胞增殖檢測，ED50為100-500 pg/mL。）
●原理
某些細胞因子（如IL-2、IL-6）能促進特定細胞系的增殖，通過檢測細胞數量或代謝活性（如CCK-8、MTT法）來計算EC50。
●實驗步驟
細胞培養：選擇依賴目標細胞因子的細胞系（如CTLL-2細胞依賴IL-2）。
梯度稀釋：將細胞因子按不同濃度加入培養體系。
檢測增殖：培養48-72小時后，用CCK-8/MTT法測OD值。
計算EC50：用GraphPad Prism等擬合劑量-反應曲線。
●優缺點
? 優點：直接反映生物學活性，結果可靠。
? 缺點：耗時長（需細胞培養），易受細胞狀態影響。
02 報告基因檢測法（高通量篩選）
●原理
構建攜帶報告基因（如熒光素酶、GFP）的工程細胞系，細胞因子激活信號通路（如STAT、NF-κB）后誘導報告基因表達，通過熒光/發光強度計算EC50。
●實驗步驟
轉染細胞：用含報告基因的質粒轉染細胞（如HEK293T-STAT3-luc）。
刺激細胞：加入不同濃度細胞因子。
檢測信號：用熒光素酶檢測系統測發光值。
數據分析：擬合曲線計算EC50。
●優缺點
? 優點：靈敏度高，適合高通量篩選。
? 缺點：需基因工程改造細胞，可能受非特異性信號干擾。
03 流式細胞術檢測（單細胞水平分析）
●原理
某些細胞因子（如IFN-γ）能誘導細胞表面標志物（如MHC-II）或磷酸化蛋白（如p-STAT1）表達，用流式細胞術定量檢測。
●實驗步驟
刺激細胞：用不同濃度細胞因子處理細胞（如THP-1細胞+IFN-γ）。
抗體標記：用熒光抗體檢測目標蛋白（如抗-pSTAT1-PE）。
流式分析：計算MFI（平均熒光強度），擬合EC50。
●優缺點
? 優點：單細胞分辨率，可多參數分析。
? 缺點：設備昂貴，數據分析復雜。
04 ELISA檢測（蛋白水平定量）
●原理
ELISA（酶聯免疫吸附試驗）可檢測細胞因子濃度，但需注意：ELISA測的是蛋白含量，不一定代表活性！若要測EC50，需結合功能實驗。
●實驗步驟
標準曲線：用重組蛋白梯度稀釋建立標準曲線。
樣本檢測：測待測樣本的OD值，計算濃度。
活性驗證：通常需結合細胞實驗（如增殖或報告基因）。
●優缺點
? 優點：操作簡單，適合大批量樣本。
? 缺點：無法區分活性與非活性形式（如結合態vs游離態）。
05 生物傳感器技術（新興方法）
●原理
利用表面等離子共振（SPR）、生物層干涉儀（BLI）等技術，實時監測細胞因子與受體的結合動力學，計算EC50。
●實驗步驟（以SPR為例）
固定受體：將細胞因子受體偶聯至芯片。
注入樣本：不同濃度細胞因子流過芯片。
檢測信號：實時監測結合-解離曲線。
計算EC50：擬合結合動力學數據。
●優缺點
? 優點：無需標記，實時監測結合活性。
? 缺點：設備昂貴，需優化結合條件。
06 其他檢測方法
qPCR：檢測細胞因子下游基因表達（如SOCS3），間接反映活性。
細胞遷移實驗：適用于趨化因子（如IL-8）的EC50測定。
蛋白質組學/磷酸化組學：全面分析細胞因子調控的分子網絡。
選擇合適的檢測方法，才能準確評估細胞因子的EC50，為藥物研發或基礎研究提供可靠數據！
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