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PriCells: 樹突細(xì)胞的分離-用小鼠骨髓前體細(xì)胞培養(yǎng)樹突細(xì)胞
PriCells: 樹突細(xì)胞的分離-用小鼠骨髓前體細(xì)胞培養(yǎng)樹突細(xì)胞
實驗材料：
1. 6-7周齡小鼠（最好為雄性鼠，因為它們的骨頭比較粗大；運輸后需要休息至少5天；不要使用應(yīng)激或脫水的老鼠）
2. 70%乙醇
3. 冰冷的以及室溫的RPMI-1640培養(yǎng)基（如Life Technologies）
4. 氯化銨溶液0.02mol/L Tris·Cl，pH7.2 /0.14mol/L NH4Cl
5. 裂解淋巴細(xì)胞的抗體（雜交瘤上清）（可選）。例如，雜交瘤RA3-3A1（B220抗體；ATCC號TIB146）、GK1.5（CD4抗體；ATCC號TIB207）、3.155（CD8抗體；ATCC號TIB211）、M5/114（MHCⅡ抗體；ATCC號TIB120）
6. 兔補體（Pel-Freez）
7. RPMI-5*培養(yǎng)基
8. 小鼠GM-CSF（mGM-CSF）：可以來源于純化的重組蛋白，也可來源于轉(zhuǎn)染小鼠GM-CSF基因的細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基
9. 用于流式細(xì)胞檢測DC的抗體：如MHCⅡ類分子的雜交瘤上清（ATCC號TIB120）、B7-2/CD86的雜交瘤上清（Pharmingen）、DEC-205的抗體（ATCC號HB290）
10. 解剖用品
11. 無菌紗布墊
12. 100mm培養(yǎng)皿（如Falcon）
13. 3ml注射器25G，5/8in（1.58cm）針頭
14. 9in（23cm）巴氏吸管（填充棉花并高壓滅菌）
15. Nytex濾器（3-40/26；Tetko）
16. 15ml和50ml聚丙烯錐底管
17. 24孔培養(yǎng)板（如Corning）
實驗方法：
1. 取小鼠股骨和脛骨，保存在置于冰上的RPMI-1640培養(yǎng)基中，直到所有的小鼠準(zhǔn)備完畢。去除骨頭上的肌肉（通常在無菌紗布墊操作）后，將干凈的骨頭置于新的平皿里。然后在含70%乙醇的培養(yǎng)皿里浸泡骨頭2min，最后用冷RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2遍。
2. 用剪刀剪去骨的兩端（骺）然后將其轉(zhuǎn)移到另外的培養(yǎng)皿中。用注射器吸取2ml RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔以獲得骨髓。在另一培養(yǎng)皿里剁碎骨骺。將剁碎的骨骺以及從骨髓腔里沖洗出來的骨髓混合在一起，用吸管打碎團塊，將懸液通過篩網(wǎng)（去除顆粒）后收于15ml或者50ml的離心管里。
3. 加入3-10ml的氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞。室溫靜置3min后，室溫，280g離心10min（1200r/min Beckman GH-3.7轉(zhuǎn)子），棄上清。
4. 去除淋巴細(xì)胞（可選）：將細(xì)胞配成1×107個細(xì)胞/ml，加入合適濃度的雜交瘤上清（通常1：20終濃度）和兔補體（通常1：17-1：20終濃度）。37℃水浴培養(yǎng)1h，每20min振蕩一次。
5. 用RPMI-1640洗滌骨髓細(xì)胞2次，室溫，280g離心10min。計數(shù)活細(xì)胞。用RPMI-5*培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個細(xì)胞/ml。
6. 加入小鼠重組GM-CSF至終濃度為700-1000U/ml或者20ng/ml。將細(xì)胞懸液一般每只小鼠可以得到4×107-5×107個骨髓細(xì)胞（沒有去除淋巴細(xì)胞）按1ml/孔接種24孔板。
7. 每2天洗滌細(xì)胞一次，每次移出舊的培養(yǎng)基，然后傾斜24孔板用RPMI-1640輕輕地沿孔壁洗滌后吸出洗滌液，最后加入1ml新的含700-1000U/ml（約20 ng/ml）mGM-CSF的RPMI-5*培養(yǎng)基（步驟6）。
8. 可選：驗證聚集物的特征--MHCⅡ類分子存在于不成熟DC的胞內(nèi)小室（MHCⅡ小室或者M(jìn)ⅡC）通過標(biāo)記〔3H〕胸腺嘧啶，可發(fā)現(xiàn)10%-20%的細(xì)胞處于S期，用流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞中度表達(dá)膜MHCⅡ類分子，但是不表達(dá)B7-2/CD86共刺激分子。
9. 在第5-8天期間（此時已產(chǎn)生足夠的聚集體），用RPMI-1640或RPMI-5培養(yǎng)基輕輕吹打，將聚集體從貼壁的基質(zhì)細(xì)胞上脫離下來（此后幾天一直會有聚集體產(chǎn)生）。收集脫離的細(xì)胞，室溫，280g離心10min，棄上清。用RPMI-5培養(yǎng)基重懸，最高濃度1×106個細(xì)胞/ml。然后鋪在直徑為100mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿10ml，最多鋪1×107個細(xì)胞。
10. 于細(xì)胞轉(zhuǎn)移后24-48h期間，每24h輕輕搖晃培養(yǎng)皿，收集非貼壁、非增殖、成熟的DC，轉(zhuǎn)移至另外的收集管中用于后期的研究。
11. 計數(shù)活細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀或者用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)大的形狀不規(guī)則的細(xì)胞來檢測DC得率（每只動物通常獲得5×106-10×106個細(xì)胞，≥60%表達(dá)成熟DC的表面標(biāo)志）。